袁可欣，譚 藝，張成玲，韋佳慧，戴雪杉，徐曉玉，陳 怡

西南大學(xué) 藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院/重慶市高校中藥新藥篩選重點實驗室/藥學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，重慶 400715

當(dāng)歸性溫味甘，歸肝、 心、 脾經(jīng)，具有補血調(diào)經(jīng)、 活血止痛的功效； 川芎性溫味辛，歸肝、 膽、 心包經(jīng)，具有活血行氣、 祛風(fēng)止痛的功效．“當(dāng)歸-川芎”常形成藥對增強其行氣活血、 補血養(yǎng)血的作用，如四物湯、 佛手散、 血府逐瘀湯、 補陽還五湯、 溫經(jīng)湯和生化湯等經(jīng)典名方[1-3]，但“當(dāng)歸-川芎”藥對的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制尚未闡明．網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合了系統(tǒng)生物學(xué)、 生物信息學(xué)的新興交叉學(xué)科，近年來，被廣泛應(yīng)用于中藥的研究中，它通過構(gòu)建“藥物-靶點-通路”多層次網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)綜合地觀察中藥對整個疾病網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用，有利于闡明中藥多成分、 多靶點、 多途徑協(xié)同作用的機制[4-5].

本研究通過TCMSP，SEA數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索，收集“當(dāng)歸-川芎”藥對活性成分及其靶點，構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，分析得到關(guān)鍵靶點，尋找其與美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)藥物靶點的共同靶點，利用TTD和TCMSP數(shù)據(jù)庫分析與共同靶點相關(guān)的疾病，建立“共同靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)．對關(guān)鍵靶點進(jìn)行基因功能和KEGG通路分析，將活性成分和關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接驗證.

1 材料與方法

1.1 “當(dāng)歸川芎”藥對活性成分的篩選

通過檢索TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php)，SEA(http：//sea.bkslab.org/)數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)，收集“當(dāng)歸-川芎”藥對中當(dāng)歸、 川芎所含成分，然后利用藥代動力學(xué)參數(shù)，即口服生物利用度OB≥30%，類藥性DL≥0.18及小腸上皮細(xì)胞滲透率Caco-2≥-0.40，篩選出當(dāng)歸、 川芎的活性成分.

1.2 “當(dāng)歸川芎”藥對“成分靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點的篩選

通過檢索TCMSP，SEA數(shù)據(jù)庫，獲得當(dāng)歸、 川芎活性成分的靶點，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt(http：//www.uniprot.org/)的搜索功能，將靶點轉(zhuǎn)換為UniProt ID導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行成分-靶點間關(guān)聯(lián)性分析，運用Cytoscape 3.5.0軟件構(gòu)建出“當(dāng)歸-川芎”藥對“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)．使用中間介數(shù)、 接近中間度、 度值3個指標(biāo)，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，選擇3個指標(biāo)均大于平均值的靶點作為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點.

1.3 共同靶點的篩選以及相關(guān)疾病分析

利用Drug Bank (https：//www.drugbank.ca/)和TTD(https：//db.idrblab.org/ttd/)數(shù)據(jù)庫，收集FDA批準(zhǔn)藥物靶點，篩選得到關(guān)鍵靶點和藥物靶點的共同靶點．利用TCMSP和TTD數(shù)據(jù)庫獲得共同靶點相關(guān)疾病，按照醫(yī)學(xué)主題詞表MeSH(http：//www.nlm.nih.gov/mesh/)將疾病分類，運用Cytoscape 3.5.0軟件構(gòu)建出“共同靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò).

1.4 關(guān)鍵靶點的富集分析和分子對接

將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行基因功能和KEGG通路富集分析．從Pubchem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取“當(dāng)歸-川芎”藥對活性成分的分子結(jié)構(gòu)，將其與關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Systems Dock Web Site(http：//systemsdock.unit.ois.jp/iddp/home/index)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分子對接．對接分?jǐn)?shù)為實驗解離/抑制常數(shù)值(pKd/pKi)的負(fù)對數(shù)，大于4.25，表明分子與靶點具有一定的結(jié)合活性； 大于5.0，表明分子與靶點結(jié)合活性較好； 大于7.0，表明分子與靶點具有強烈的穩(wěn)定性及活性.

2 結(jié) 果

2.1 “當(dāng)歸川芎”藥對的活性成分

通過檢索TCMSP，SEA數(shù)據(jù)庫，獲得當(dāng)歸成分125個，川芎成分189個，閾值設(shè)定為OB≥30%，DL≥0.18以及Caco-2≥-0.40，共篩選出候選活性成分8個，其中當(dāng)歸2個，川芎6個．通過查閱文獻(xiàn)獲得10個活性成分，其中當(dāng)歸4個，川芎6個．去除重復(fù)成分，最終得到14個活性成分，其中川芎和當(dāng)歸共有活性成分4個，分別是咖啡酸、 阿魏酸、 洋川芎內(nèi)酯I、 藁本內(nèi)酯(表1).

表1 “川芎當(dāng)歸”藥對的活性成分

2.2 “當(dāng)歸-川芎”藥對的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

利用TCMSP，SEA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)川芎12個活性成分對應(yīng)127個靶點，當(dāng)歸6個活性成分對應(yīng)337個靶點，刪除重復(fù)的靶點，“當(dāng)歸-川芎”藥對14個活性成分對應(yīng)257個靶點．“當(dāng)歸-川芎”藥對的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)包含257個節(jié)點和2 388條邊(圖1)．分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的中間介數(shù)、 接近中間度及度值的平均值，分別為0.003 5，0.441 1，16.925 3，篩選3個指標(biāo)均大于等于平均值的靶點，得到54個關(guān)鍵靶點，其中11個是當(dāng)歸和川芎共有靶點，分別是PTGS1，VDR，PTGS2，CDC25A，CYP19A1，NR1H4，PRKACA，AR，ESR2，ADRB2，NCOA2，這些靶點可能是川芎和當(dāng)歸協(xié)同作用的物質(zhì)基礎(chǔ).

兩邊的六邊形分別表示川芎和當(dāng)歸的有效成分，其中淺紫色的表示當(dāng)歸和川芎的共有成分，中間的橙色圓形表示“當(dāng)歸-川芎”藥對的靶點，紫色圓形表示關(guān)鍵靶點，黃色圓形表示關(guān)鍵靶點中的共有靶點．圖1 “當(dāng)歸川芎”藥對“成分靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.3 “共同靶點疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過TTD和Drug Bank數(shù)據(jù)庫，獲得1 215個FDA批準(zhǔn)藥物靶點，54個關(guān)鍵靶點和FDA批準(zhǔn)藥物靶點有34個共同靶點．通過TTD和TCMSP數(shù)據(jù)庫分析，構(gòu)建的“共同靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)由168個點和264條邊組成，共同靶點與21組共113種疾病相關(guān)，包括腫瘤(14.2%)、 神經(jīng)系統(tǒng)疾病(12.4%)、 心血管疾病(8.8%)、 心理疾病(8.8%)、 病理狀況(7.1%)和女性生殖系統(tǒng)疾病(5.9%)等(圖2)，這可能是“當(dāng)歸-川芎”藥對潛在的治療靶點和對應(yīng)的疾病.

紅色橢圓代表關(guān)鍵靶點和FDA批準(zhǔn)藥物靶點的共同靶點，紫色菱形代表疾病，黃色長方形代表疾病所屬大類，根據(jù)MeSH分為21組．圖2 關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 基因功能及KEGG通路富集分析

34個共同靶點提示的是“當(dāng)歸-川芎”藥對潛在作用的疾病，而54個關(guān)鍵靶點能更全面地反映“當(dāng)歸-川芎”藥對的成分靶點，因此將54個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，從生物學(xué)過程、 分子功能和細(xì)胞組分3個不同的方面對基因功能進(jìn)行分析．結(jié)果顯示，54個關(guān)鍵靶點共涉及155個生物過程、 29個細(xì)胞組分和66個分子功能，其中生物過程中排名前5的有Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter(19個靶點/35.2%)，Transcription DNA-templated(14個靶點/25.9%)，Signal transduction(13個靶點/24.1%)，Negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter(12個靶點/22.2%)，Response to drug(11個靶點/20.4%)．細(xì)胞組分中排名前5的有Nucleus(34個靶點/63%)，Plasma membrane(27個靶點/50.0%)，Nucleoplasm(24個靶點/44.4%)，Cytosol(23個靶點/42.6%)，Cytoplasm(23個靶點/42.6%)．分子功能中排名前5的有Protein binding(46個靶點/85.2%)，Enzyme binding(19個靶點/35.2%)，Transcription factor activity，Sequence-specific DNA binding(13個靶點/24.1%)，DNA binding(13個靶點/24.1%)，Protein homodimerization activity(12個靶點/22.2%)(圖3)．這表明“當(dāng)歸-川芎”藥對可能參與了人體內(nèi)的多種生物過程.

圖3 排名前5的基因功能分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，54個關(guān)鍵靶點共參與58條信號通路過程，其中包括Pathways in cancer，Estrogen signaling pathway，Proteoglycans in cancer，Calcium signaling pathway，HIF-1 signaling pathway等，涉及癌癥、 黏附、 細(xì)胞周期、 炎癥、 細(xì)胞凋亡、 血管生成及激素調(diào)節(jié)等，表2展示了涉及靶點數(shù)目排名前20的通路信息.

表2 排名前20的KEGG通路信息

2.5 “當(dāng)歸川芎”藥對活性成分與關(guān)鍵靶點有結(jié)合活性

將“當(dāng)歸-川芎”藥對活性成分豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎內(nèi)酯A、 藁本內(nèi)酯、 阿魏酸和4-羥基-3-丁基苯酞與度值排名前10的關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接．結(jié)果表明，6個活性成分與7個靶點對接成功，其中豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎內(nèi)酯A、 藁本內(nèi)酯與NCOA2，ESR2，EP300，ESR1等靶點有較好的結(jié)合活性以及穩(wěn)定性(表3).

表3 “當(dāng)歸川芎”藥對活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接

3 討 論

當(dāng)歸、 川芎都是血分之主藥，當(dāng)歸味甘，具有養(yǎng)血活血之功效，川芎味辛，是血中氣藥，具有活血祛瘀、 行血散血的功效，兩者相使配伍同用，可增強活血化瘀、 養(yǎng)血活血之功效，因此“當(dāng)歸-川芎”常作為活血化瘀的藥對使用，但它們配伍增效的物質(zhì)基礎(chǔ)并未闡明，我們通過數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索獲得川芎和當(dāng)歸14個有效成分，其中4個共有成分，分別是咖啡酸、 阿魏酸、 洋川芎內(nèi)酯I、 藁本內(nèi)酯．其中咖啡酸和阿魏酸是酚酸類成分，咖啡酸在機體內(nèi)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下可轉(zhuǎn)化成阿魏酸，而阿魏酸具有抗氧化、 抗血栓、 降血脂、 降低心肌缺氧、 抗菌、 抗腫瘤和腦保護等多種藥理作用[6-7]．洋川芎內(nèi)酯I和藁本內(nèi)酯是苯酞類成分，洋川芎內(nèi)酯I具有保護腦、 抗凝血作用，藁本內(nèi)酯具有抗動脈粥樣硬化、 抗炎鎮(zhèn)痛、 抗老年癡呆、 抗腦缺血、 抗腫瘤、 抗脂質(zhì)過氧化、 改善微循環(huán)等作用[8-9]．這些共有成分可能是“當(dāng)歸-川芎”藥對配伍增效的物質(zhì)基礎(chǔ)，可以進(jìn)一步通過成分敲出、 敲入等技術(shù)來驗證.

“當(dāng)歸-川芎”常常配對使用，尤其多見于一些治療婦科疾病的名方，比如四物湯、 佛手散、 血府逐瘀湯、 溫經(jīng)湯等．通過數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建和分析“當(dāng)歸-川芎”藥對的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，獲得54個關(guān)鍵靶點，其中11個是川芎和當(dāng)歸共有靶點，分別是PTGS1，VDR，PTGS2，CDC25A，CYP19A1，NR1H4，PRKACA，AR，ESR2，ADRB2，NCOA2．有研究發(fā)現(xiàn)PTGS2是FDA批準(zhǔn)的治療子宮內(nèi)膜異位癥的靶點之一[10]，而且“當(dāng)歸-川芎”藥對中的阿魏酸和川芎嗪能抑制PTGS2的表達(dá)[11-14]．CYP19A1參與雌激素合成，ESR2是雌激素受體，分子對接結(jié)果中，豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎內(nèi)酯A、 藁本內(nèi)酯與ESR2有較好的結(jié)合活性，也有研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸和川芎嗪能抑制雌激素水平[4，10]，但是“當(dāng)歸-川芎”藥對及其活性成分對CYP19A1和ESR2的作用還未見報道，值得研究．其中34個關(guān)鍵靶點也是FDA批準(zhǔn)藥物靶點，PTGS2，ESR2可作為治療女性生殖系統(tǒng)疾病及妊娠并發(fā)癥的靶點，進(jìn)一步KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵靶點調(diào)控多條與雌激素、 孕激素相關(guān)的通路，包括Estrogen signaling pathway，Oxytocin signaling pathway，Progesterone-mediated oocyte maturation，GnRH signaling pathway，Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption，這可能是“當(dāng)歸-川芎”配對用于治療婦科疾病的機制，值得進(jìn)一步深入研究.