張寶貴 (天津市靜海區(qū)醫(yī)院普外科，天津 301600)

乳腺癌(breast cancer)在女性發(fā)病率為第一位，新進(jìn)的流行病學(xué)研究顯示，2019年全美預(yù)計乳腺癌新發(fā)病例271 270例，當(dāng)年因乳腺癌死亡人數(shù)為42 260例[1]。乳腺癌已成為導(dǎo)致女性死亡的重要原因。我國腫瘤流行病數(shù)據(jù)顯示2015年乳腺癌新發(fā)病例272 400，死亡人數(shù)為707 000例[2]。從數(shù)據(jù)中可以看出，我國乳腺癌患者預(yù)后差于歐美等發(fā)達(dá)國家。

Zeste同源物2增強(qiáng)子EZH2基因定位于人7染色體q36.1，全長為7 693 bp，編碼蛋白為多梳蛋白復(fù)合體PcG (Polycomb group)家族重要成員之一[3]。EZH2編碼蛋白為賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(酶代碼EC2.1.1.43)，參與組蛋白甲基化，為重要的基因表達(dá)調(diào)控因子。在本研究中，筆者通過多個數(shù)據(jù)庫對乳腺癌EZH2基因表達(dá)的臨床意義進(jìn)行了分析，探討EZH2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，并分析了其共表達(dá)蛋白網(wǎng)絡(luò)，為EZH2靶向調(diào)控乳腺癌的生物學(xué)功能及臨床靶向藥物研發(fā)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫選擇：分別選擇腫瘤基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)庫Oncomie(https://www.oncomine.org/),生存分析數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)和蛋白-蛋白相互作用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)對EZH2基因表達(dá)情況及其臨床意義進(jìn)行分析。

1.2Oncomine，Kaplan-Meier Plotter和String數(shù)據(jù)庫挖掘

1.2.1Oncomine數(shù)據(jù)庫分析：首先對Oncomie數(shù)據(jù)庫EZH2基因檢索，初步評估EZH2基因mRNA在多種腫瘤組織中的表達(dá)情況(高表達(dá)或低表達(dá))，然后選擇乳腺癌進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。數(shù)據(jù)挖掘條件為：①腫瘤類型：乳腺癌；②標(biāo)本類型：手術(shù)切除標(biāo)本；③組織對比：乳腺癌vs 正常乳腺組織；④數(shù)據(jù)類型：mRNA；⑤顯著性：P<1E-4；⑥差異表達(dá)級別：大于2倍；⑦基因排序：前10%。

1.2.2Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫生存分析：檢索該數(shù)據(jù)庫中乳腺癌EZH2 mRNA預(yù)后數(shù)據(jù)，選擇總生存期和無疾病進(jìn)展生存期進(jìn)行分析。根據(jù)EZH2 mRNA中位表達(dá)水平分為高表達(dá)和低表達(dá)組，進(jìn)行比較。繪制生存曲線，計算中位生存時間及生存風(fēng)險比(HR)和95%置信區(qū)間(95%CI)。

1.2.3String 數(shù)據(jù)庫蛋白相互作用分析：在該數(shù)據(jù)庫中，對EZH2蛋白相關(guān)的蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選條件為相關(guān)性大于0.9。同時進(jìn)行共表達(dá)分析，繪制共表達(dá)和相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1EZH2基因mRNA在腫瘤與正常組織差異表達(dá)：EZH2基因mRNA在腫瘤組織與對應(yīng)正常組織中的研究共449項，其中存在差異的研究74項，68項研究EZH2 mRNA在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，6項研究下調(diào)。在乳腺癌中，上調(diào)表達(dá)的有8項，見圖1。

圖1 EZH2 基因mRNA在多種實體腫瘤與對應(yīng)正常組織中的整體表達(dá)

2.2EZH2 mRNA在乳腺癌與正常乳腺組織中的差異表達(dá)：Oncomine數(shù)據(jù)庫中，有三項基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)關(guān)于EZH2在乳腺癌與正常組織中的差異表達(dá)分析，其中一項來自TCGA數(shù)據(jù)庫(http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)，另兩項來自已發(fā)表文獻(xiàn)[4-5]。三項基因芯片結(jié)果包含了11個數(shù)據(jù)系列，分別對比了不同乳腺癌病理組織類型于對應(yīng)的正常乳腺組織EZH2 mRNA表達(dá)結(jié)果，11個數(shù)據(jù)系列的薈萃分析顯示，EZH2 mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.05)。

2.3EZH2 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者生存期：應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中乳腺癌EZH2基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析EZH2高低表達(dá)于乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示EZH2高低表達(dá)組總生存期分別為79.2個月和120.0個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HR=1.31 95%CI:1.05～1.62,P<0.05)，而高低表達(dá)組無疾病進(jìn)展生存期分別為34.8個月和74.0個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HR=1.49,95%CI:1.34～1.67,P<0.05)。見圖2。

2.4EZH2相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)：在String數(shù)據(jù)庫中分析EZH2相互作用的蛋白，富集條件為p=2E-15，節(jié)點數(shù)共11個。見圖3。作用評分均大于0.9。上述相互作用蛋白大多為多梳蛋白家族，大多與組蛋白修飾有關(guān)。共表達(dá)分析顯示EZH2蛋白于SUZ12,EED，AEBP2等蛋白具有共表達(dá)關(guān)系。

圖3 EZH2基與表達(dá)蛋相關(guān)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

EZH2蛋白為多梳蛋白復(fù)合體家族重要成員之一，該蛋白具有甲基化活性可促進(jìn)異染色質(zhì)的形成，從而沉默基因功能。在細(xì)胞有絲分裂過程中，EZH2也需要重塑染色體異染色質(zhì)[6-7]。EZH2蛋白是組蛋白甲基化重要的工具酶，能夠催化H3K27(組蛋白H3賴氨酸27位)甲基化，促進(jìn)多個癌基因的表達(dá)[8]。EZH2是多梳抑制復(fù)合物2(prc2)的催化亞單位。EZH2的催化活性取決于它與suz12和eed形成的復(fù)合物。作為多梳抑制復(fù)合物2的一部分EZH2蛋白可催化組蛋白h3k27(h3k27me3)的三甲基化，從而導(dǎo)致調(diào)控基因表達(dá)[9-11]。

(A:總生存比較；B:無疾病進(jìn)展生存比較)圖2 EZH2 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系生存曲線

已有研究認(rèn)為與正常組織比較，EZH2在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，如乳腺癌[12]、胃癌[13-14]、肺癌等[15-16]，并與患者的臨床病理特征如腫瘤分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等存在潛在的相關(guān)性。沙聰?shù)热瞬捎肊ZH2在免疫組化方法探討EZH2蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。研究顯示乳腺癌組織中EZH2陽性表達(dá)與腫瘤大小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)有關(guān)，且EZH2陽性表達(dá)患者遠(yuǎn)期生存率低于陰性乳腺癌患者[17]。

應(yīng)用免疫組化技術(shù)雖然可以在一定程度上分析EZH2表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系。但免疫組化為半定量分析，其操作相對復(fù)雜，受到影響的因素較多。同時，該方法大多用于單個樣本檢測，無法實現(xiàn)高通量快速檢測。隨著表達(dá)譜芯片和二代測序技術(shù)的成熟，基因表達(dá)高通量分析成為篩選腫瘤患者預(yù)后因素和靶向藥物的重要手段[18]。在本研究中，筆者綜合分析了多個生物信息數(shù)據(jù)庫，并對乳腺癌中EZH2的表達(dá)情況及其與患者的預(yù)后進(jìn)行了分析。結(jié)果認(rèn)為與正常的乳腺組織相比，乳腺癌組織中EZH2 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，并與患者生存時間較短有關(guān)，與既往文獻(xiàn)報道基本一致。EZH2蛋白與SUZ12,EED，AEBP2蛋白相互作用并呈現(xiàn)共表達(dá)趨勢。EZH2蛋白與SUZ12,EED，AEBP2多為參與組蛋白修飾的因子，其協(xié)同表達(dá)共同參與組蛋白生物學(xué)功能，進(jìn)而對相關(guān)基因的表達(dá)起到重要的調(diào)控作用。