代孟祝 (四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 廣安 638500)

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤。我國是胃癌高發(fā)國家，據(jù)統(tǒng)計(jì)2015年我國胃癌發(fā)病人數(shù)僅次于肺癌，同時(shí)胃癌相關(guān)死亡人數(shù)在所有惡性腫瘤中高居第三位，且胃癌的發(fā)病率仍呈現(xiàn)上升趨勢[1]。近年來，隨著診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，我國胃癌早期發(fā)現(xiàn)率顯著提高，預(yù)后有明顯改善，且晚期胃癌的預(yù)后仍較差，5年生存率不到10%[2-4]。小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～25堿基的短鏈非編碼RNA，盡管miRNA不編碼蛋白，但成熟的miRNA可以與mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，研究表明miRNA表達(dá)異常與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]，因此miRNA具有潛在的診斷和預(yù)測價(jià)值?；趍iRNA表達(dá)譜的系統(tǒng)性標(biāo)志物篩選對胃癌發(fā)病機(jī)理、治療靶點(diǎn)開發(fā)和預(yù)后評估具有重要意義。目前關(guān)于胃癌預(yù)后miRNA的系統(tǒng)性研究較少，本研究基于癌癥基因圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中公開的胃癌miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，提取臨床信息，利用Cox回歸分析篩選胃癌預(yù)后相關(guān)miRNAs，并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評分模型，同時(shí)對預(yù)后miRNA進(jìn)行功能分析，揭示miRNA在胃癌中的調(diào)控作用和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評估中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載與處理：利用R(version 4.0.0)中RTCGA包下載TCGA數(shù)據(jù)庫中胃腺癌(Stomach adenocarcinoma，STAD)的miRNA數(shù)據(jù)，提取RNA表達(dá)矩陣和患者臨床資料，該數(shù)據(jù)包括41例正常組織樣本和436例胃癌樣本。對提取的表達(dá)矩陣依次過濾0值和低表達(dá)miRNA，去除正常組織樣本和臨床信息不完整的胃癌樣本，最后對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和Log2轉(zhuǎn)換，獲得389個(gè)胃癌樣本的618個(gè)miRNA表達(dá)矩陣用于后續(xù)分析。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2Cox回歸分析構(gòu)建STAD預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型：利用R中的Survival包對618個(gè)miRNA依次進(jìn)行單變量Cox回歸分析，根據(jù)P<0.05篩選與預(yù)后相關(guān)的miRNA。利用R中的Survival包對預(yù)后相關(guān)的miRNA進(jìn)行Cox 多變量回歸分析，構(gòu)建比例風(fēng)險(xiǎn)模型，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評分(Risk Score)，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)將患者劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并繪制生存曲線(Kaplan-Meier法，KM曲線)和受試者工作特征(ROC)曲線，評估模型預(yù)測效果。

1.3miRNA靶基因功能分析：利用在線預(yù)測工具miRWalk (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)對STAD預(yù)后相關(guān)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測[6]，min P-value為>0.95，結(jié)合區(qū)域?yàn)?′ UTR，輸出與TargetScan數(shù)據(jù)庫共有的靶基因，利用R包對靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1STAD預(yù)后miRNA篩選及風(fēng)險(xiǎn)評分模型：通過單變量Cox回歸分析共篩選到33個(gè)STAD預(yù)后相關(guān)的miRNA(P<0.05)，將篩選到的33個(gè)miRNA進(jìn)行多變量Cox回歸分析確定最優(yōu)模型，得到14-miRNA的STAD預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評估模型。根據(jù)β>0且HR>1表明hsa-mir-184、hsa-mir-7-1、hsa-mir-541、hsa-mir-597、hsa-mir-676和hsa-mir-3143等miRNA為胃癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素，根據(jù)β<0且HR<1表明hsa-mir-3648、hsa-mir-7-2、hsa-mir-362、hsa-mir-3161、hsa-mir-3610和hsa-mir-320c-2等miRNA為STAD預(yù)后保護(hù)因素。見表1。

表1 Cox回歸分析結(jié)果

根據(jù)構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評分模型，對所有患者計(jì)算Risk Score，根據(jù)Risk Score將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行生存分析，繪制KM曲線見圖1，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)繪制ROC曲線見圖2，結(jié)果顯示AUC面積為0.793，提示模型具有較好的預(yù)測效果。

圖1 基于14-miRNA風(fēng)險(xiǎn)評分的胃腺癌患者KM生存曲線

圖2 14-miRNA預(yù)后預(yù)測模型ROC曲線

2.2胃癌預(yù)后相關(guān)miRNA靶基因功能分析：對14個(gè)胃癌預(yù)后miRNA利用miRWalk在線分析工具進(jìn)行靶基因預(yù)測，預(yù)測靶基因共355個(gè)基因，對靶基因進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示主要信號(hào)通路為：細(xì)胞衰老、膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、人巨細(xì)胞病毒感染、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、cAMP信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、FoxO信號(hào)通路、黑色素瘤和乙型肝炎等信號(hào)通路。見圖3。

圖3 預(yù)后miRNA靶基因信號(hào)通路富集分析

3 討論

研究表明miRNA參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等生物學(xué)過程，miRNA可以抑制癌基因或抑癌基因的表達(dá)，miRNA通常調(diào)控1個(gè)或多個(gè)靶基因而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[6]。近年來，大量研究報(bào)道了胃癌相關(guān)miRNA標(biāo)志物及相關(guān)機(jī)理，如Zhu等發(fā)現(xiàn)miR-6165在胃癌組織中低表達(dá)，靶向調(diào)控STRN4表達(dá)上調(diào)進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲[7]。又如Ting等報(bào)道發(fā)現(xiàn)，胃癌來源的外泌體中miR-155可以抑制靶基因c-MYB表達(dá)同時(shí)上調(diào)VEGF表達(dá)，促進(jìn)胃癌增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成[8]。此外Bie等發(fā)現(xiàn)晚期胃癌患者血清中miR-191和miR-425是FOLFOX化療敏感性獨(dú)立預(yù)測因子[9]。這些研究表明miRNA參與胃癌細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和耐藥等一系列過程，是胃癌潛在的預(yù)后因子。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫篩選與胃腺癌預(yù)后相關(guān)的miRNA，利用Cox回歸分析構(gòu)建了基于14-miRNA的胃腺癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評分模型，AUC面積為0.793，表明該模型的預(yù)后預(yù)測效果較好。本研究篩選到hsa-mir-184、hsa-mir-7-1、hsa-mir-541、hsa-mir-597、hsa-mir-676、hsa-mir-3143、hsa-mir-450a-1和hsa-mir-1911等胃癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素，其中hsa-mir-184在乳腺癌[10]、腎癌[11]、膠質(zhì)瘤[12]和肝細(xì)胞癌[13]等多種癌癥中高表達(dá)，通過上調(diào)c-Myc、SND1等基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移；先前的研究發(fā)現(xiàn)hsa-mir-184在胃癌中高表達(dá)且與胃腺癌的預(yù)后不良相關(guān)[14]，與本研究結(jié)果一致，但分子機(jī)制仍不明確；研究發(fā)現(xiàn)miR-7-1是多種癌癥中的抑癌因子，抑制miR-7-1生成可以激活其靶基因如EGF受體蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[15]。相反，本研究結(jié)果提示miR-7-1可能是促癌因素，其在胃癌中的作用仍需進(jìn)一步探究；另有研究表明，hsa-mir-541可以通過調(diào)控TMPRSS4表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和EMT[16]，但本研究表明hsa-mir-541可能具有促癌作用。此外，本研究結(jié)果表明hsa-mir-3648、hsa-mir-7-2、hsa-mir-362、hsa-mir-3161、hsa-mir-3610和hsa-mir-320c-2等miRNA為潛在的抑癌因子。研究發(fā)現(xiàn)hsa-mir-3648可以靶向TCF21基因促進(jìn)膽管癌增殖[17]，hsa-mir-362與多種癌癥相關(guān)。Wei 等采用miRNA芯片篩選順鉑敏感的人胃癌細(xì)胞株SGC7901與相應(yīng)的順鉑耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP之間差異miRNA發(fā)現(xiàn)，hsa-mir-362在SGC7901/DDP細(xì)胞中低表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-362-5p通過靶向SUZ12增加順鉑敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示miR-362-5p是抑癌因子[18]。miRNA與靶基因作用是復(fù)雜的，可能通過1個(gè)或多個(gè)miRNA調(diào)控1個(gè)或多個(gè)靶基因，從而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，基于生物信息學(xué)手段結(jié)合數(shù)據(jù)庫的大樣本量分析可以更系統(tǒng)地展示miRNA與癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，及其調(diào)控的潛在信號(hào)機(jī)制。本研究中對miRNA靶基因的KEGG富集分析得到多種癌癥相關(guān)信號(hào)通路，如細(xì)胞衰老、膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、cAMP信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、黑色素瘤、肝癌、VEGF信號(hào)通路、胃癌和mTOR信號(hào)通路，其中FoxO、VEGF和mTOR等信號(hào)均為腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路[10-21]。此外還有脂質(zhì)和膽汁酸相關(guān)代謝通路，表明這些miRNA可能通過影響胃癌細(xì)胞增殖信號(hào)進(jìn)而影響預(yù)后，具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，基于大樣本量數(shù)據(jù)篩選胃癌預(yù)后miRNA并預(yù)后評估模型具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，胃癌預(yù)后相關(guān)miRNA通過多種機(jī)制參與胃癌調(diào)控，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探究與驗(yàn)證。