馬偉杰，白金喜，李江平，王 斌 (.廣州市南沙區(qū)中醫(yī)醫(yī)院外二科，廣東 廣州 546；.佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東 佛山 5800)

骨重塑主要受成骨細胞代謝和破骨細胞代謝之間的平衡控制[1]。成骨細胞是指在調節(jié)產后骨形成中起重要作用的成骨細胞。破骨細胞是骨基質中溶解無機成分的吸收細胞。成骨細胞通過產生骨基質蛋白和堿性磷酸酶(ALP)促進骨形成，誘導骨基質礦化。成骨細胞分化是由各種生長因子和激素觸發(fā)的，這些因子和激素有助于骨骼發(fā)育和改善骨骼發(fā)育[2]。因此，試圖改善成骨細胞分化是一種潛在的、有前途的治療骨損傷和骨丟失策略，如防治骨質疏松癥或骨折。

microRNA(miRNA)是成骨細胞分化的關鍵調節(jié)劑。據報道，miRNAs參與了各種生物反應，包括細胞增殖、凋亡和分化[3]。miRNAs在成骨細胞分化和骨形成中起著重要的協(xié)調作用。然而，miRNAs在成骨細胞分化中的精確調控網絡仍不清楚。有研究在成骨細胞分化的誘導過程中，miR-193a-3p的表達發(fā)生了改變影響成骨細胞分化過程，誘導mRNA的降解和翻譯抑制[4]。

LGR4又稱G蛋白偶聯(lián)受體48，是G蛋白偶聯(lián)受體的成員[5]，在各種生理功能中起著至關重要的作用。越來越多的研究表明，LGR4在調節(jié)骨形成和重塑中起著重要作用。研究表明，LGR4促進成骨細胞分化同時抑制破骨細胞分化[6]。因此，LGR4是骨形成的關鍵調節(jié)因子，是改善骨疾病的一個有用的靶點。

近年來，miR-193a-3p由于其在各種生物過程中的重要作用而得到了廣泛的研究。 先前的一項研究報道，在誘導成骨細胞分化過程中，miR-193a-3p的表達發(fā)生了改變[7]。 然而，miR-193a-3p在成骨細胞分化過程中的作用靶點和調控機制尚不清楚。本研究旨在探討miR-193a-3p在調節(jié)成骨細胞分化中的確切靶點及其機制。

研究方案按照1964年赫爾辛斯基宣言有關規(guī)定，經由佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院和廣州市南沙區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審查通過。選取兩院2019年7月～2021年1月收治的骨質疏松患者20例。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)和成骨細胞分化：骨髓間充質干細胞細胞模型(hBMSCs)由髂前上棘骨穿刺術取骨質疏松患者骨髓組織，在DMEM-F12(Gibco，美國)中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清(TaKaRa，中國)，2 mm L -谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素混合。293T細胞由中國科學院干細胞庫(上海)提供，在DMEM(Gibco，美國)中培養(yǎng)，補充10%FBS和1%青霉素-鏈霉素混合物。 細胞維持37℃時，含有5%CO2和95%的空氣。為了誘導成骨細胞分化，將BMSCs培養(yǎng)在含有100 nm地塞米松、10 mMb-甘油磷酸和50 mM抗壞血酸的成骨分化培養(yǎng)基中。每2天更新一次。

1.2細胞轉染:Agomi R-193a-3p、antagomi R-193a-3p及其陰性對照從基因公司(TaKaRa，中國)購買，并根據制造商的協(xié)議，使用Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(賽默飛公司，美國)轉染細胞。LGR4和ATF4 shRNA Lentiviral顆粒(賽默飛公司，美國)按照Manu-facturer的指示轉化為細胞。

1.3RNA提取與實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR):總RNA的提取使用TRIZOL試劑(鐸洋生物有限公司，廣州)遵循制造商的協(xié)議。為了檢測miRNA，使用TaqMan微RNA反向轉錄試劑盒(TaKaRa，中國)進行cDNA合成，并使用TaqMan微RNA檢測試劑盒(TaKaRa，中國)進行RT-qP CR進行cDNA擴增。對于mRNA的檢測，使用M-MLV反轉錄酶(TaKaRa，中國)進行逆轉錄，并使用Power SYBR Green PCR Master Mix(鐸洋生物有限公司，廣州)進行cDNA的擴增。以GAPDH為內參，進行mRNA表達正?；?。比較用2-ΔΔCT方法對數(shù)據進行分析，并將其表示為與對照相比的變化。

1.4ALP活性的測定:用ALP測定試劑盒(伯樂公司，美國)測定活性。細胞被俘獲后，用裂解緩沖液溶解。離心后收集上清液，然后轉移到96孔板中。然后，將上清液與對硝基苯磷酸酯(PNPP)和反應緩沖液在37°C下孵育10 min，最后使用酶標儀在570 nm下測試了吸光度值(OD值)。

1.5基質礦化的檢測:采用茜素紅(ARS)(伯樂公司，美國)染色法測定基質礦化。細胞用PBS洗滌，然后，用4%甲醛固定細胞1 h，室溫下用40 mM ARS溶解(伯樂公司，美國)孵育15 min。用蒸餾水洗滌細胞，除去未結合的染料分子，在37℃下溶解10%十六烷基吡啶氯化銨30 min，檢測540 nm處的OD值。

1.6雙熒光素酶報告試驗:用PCR擴增含有miR-193a-3p結合序列的小鼠LGR4 3′-UTR，并將其插入pmirGLO報告載體(Promega，美國)。結合區(qū)域突變在LRG43′-UTR是產生的一種快速改變定向突變試劑盒(Stratagene，美國)。用LipofectamineRNAiMAX轉染試劑(伯樂公司，美國)將構建的pmirGLO-LGR4 3′-UTR載體與AgomiR-193a-3p共轉染293T細胞。在孵育48 h后，用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)(Promega，美國)測量熒光素酶活性。用光度計檢測熒光素酶活性，將螢火蟲熒光素酶活性標準化為Renilla熒光素酶活性。

2 結果

2.1miR-193a-3p在成骨細胞分化過程中表達下調:為了探討miR-193a-3p在成骨細胞分化中的潛在作用，我們研究了miR-193a-3p在成骨細胞分化過程中的表達變化。培養(yǎng)BMSCs誘導成骨細胞分化，在第1天、第7天和第14天測定miR-193a-3p的表達水平。結果表明，miR-193a-3p的表達水平在成骨細胞分化過程中，以時間依賴性的方式顯著下調(見圖1)。結果表明，miR-193a-3p可能在成骨細胞分化中起重要作用。

圖1 miR-193a-3p在成骨細胞分化過程中的表達水平

2.2miR-193a-3p調節(jié)骨髓間充質干細胞的成骨細胞分化:為了研究miR-193a-3p是否調節(jié)成骨細胞的分化，我們分別通過轉染AgomiR-193a-3p和AntagomiR-193a-3p在BMSCs中進行了過表達實驗。我們發(fā)現(xiàn)轉染AgomiR-193a-3p的BMSCs水平上調，而轉染AntagomiR-193a-3p的BMSCs水平下調。見圖2。

圖2 轉染AgomiR-193a-3p和AntagomiR-193a-3p在BMSCs中過表達

為了研究miR-193a-3p的精確生物學功能，我們檢測了miR-193a-3p對ALP活性和基質礦化的影響。結果表明，miR-193a-3p的過表達下調了BMSCs的ALP活性，抑制了BMSCs的基質礦化。見圖3。

圖3 miR-193a-3p對ALP活性和基質礦化的影響

評估m(xù)iR-193a-3p對成骨細胞標記基因Runx2表達的調節(jié)作用。結果表明，miR-193a-3p的過表達則下調Runx2的表達。見圖4。

圖4 miR-193a-3p的過表達時Runx2的表達

2.3確定LGR4為miR-193a-3p的靶基因:為了闡明miR-193a-3p調控成骨細胞分化的潛在機制，我們利用生物信息學分析方法尋找了miR-193a-3p的候選靶基因。我們發(fā)現(xiàn)LGR4是骨形成的關鍵調節(jié)因子，被預測為miR-193a-3p的潛在靶基因。LGR4mRNA的3′-UTR對miR-193a-3p具有保守的結合位點。見圖5。

為了驗證miR-193a-3p是否直接針對LGR4，我們構建了含有野生型(WT)或突變型(MT)結合位點的LGR4 3′-UTR的熒光素酶記者。熒光素酶報告試驗表明，miR-193a-3p的過表達顯著降低了含有WT結合位點的LGR4 3′-UTR熒光素酶報告者的熒光素酶活性。然而，miR-193a-3p的過表達對含有miR-193a-3pMT結合位點的LGR43′-UTR熒光素酶沒有明顯影響。見圖6。

圖6 熒光素酶報告試驗miR-193a-3p的過表達對WT、MT結合位點的LGR43′-UTR

檢測miR-193a-3p對LGR4表達的調節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p的過表達顯著下調LGR4的表達。見圖7。

圖7 檢測miR-193a-3p對LGR4表達的調節(jié)作用

綜上所述，這些結果表明miR-193a-3p直接與LGR4 3′-UTR結合，并負調控LGR4的表達。

2.4miR-193a-3p通過LGR4調節(jié)ATF4的表達:為了進一步研究miR-193a-3p在調節(jié)成骨細胞分化中的分子基礎，我們檢測了miR-193a-3p對調節(jié)骨信息的LRG4下游靶點ATF4表達的調節(jié)作用。結果顯示miR-193a-3p的過表達顯著降低了ATF4的表達，而miR-193a-3p的抑制促進了ATF4的表達。見圖8。

圖8 miR-193a-3p對調節(jié)骨信息的LRG4下游靶點ATF4表達的調節(jié)作用

3 討論

miR-193a-3p是一種重要的調節(jié)成骨細胞分化的因子，據報道，miR-193a-3p在各種細胞過程中起著重要作用[8]。miR-193a-3p參與各種細胞的細胞分化。miR-193a-3p被報道用于調節(jié)髓系前體的分化，在急性髓系白血病中起著重要作用[9]。然而，miR-193a-3p是否參與成骨細胞分化尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p在誘導成骨細胞分化過程中明顯下調。miR-193a-3p是人脂肪源干細胞[10]成骨細胞分化過程中下調的miRNAs之一。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-193a-3p促進了BMSCs的成骨細胞分化，而miR-193a-3p的過度表達則抑制了BMSCs的成骨細胞分化，表明miR-193a-3p在成骨細胞分化中起著重要作用。最近的一項研究報告miR-193a-3p通過靶向高遷移率組蛋白1抑制BMSCs成骨細胞分化[11]，提示miR-193a-3p在調節(jié)成骨細胞分化具有明顯的機制性。以上支持miR-193a-3p通過調節(jié)成骨細胞分化在骨形成中的重要作用。LGR4已成為骨形成的重要調節(jié)因子。 LGR4基因敲除小鼠成骨細胞分化受損。LGR4的表達受骨形態(tài)基因蛋白2的調控，該蛋白能誘導成骨細胞在體外中的分化。研究表明，LGR4通過環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A通路激活ATF4的表達，促進成骨細胞分化和骨形成[4]。LGR4介導的Wnt/b-catenin信號通路也有助于促進成骨細胞的分化。LGR4已被鑒定為R-海綿蛋白2的受體，通過激活Wnt/b-catenin信號通路促進成骨細胞分化[12]。阻斷LGR4可阻礙干細胞分化，并干擾Wnt/β-catenin信號。除了調節(jié)成骨細胞的差異，LGR4還調節(jié)破骨細胞的分化。研究表明，LGR4結合RANKL在體外和體內抑制破骨細胞分化[13]。下調LGR4參與誘導RAW264.7細胞分化，通過調節(jié)成骨細胞分化和破骨細胞分化來重塑。在本研究中，我們確定LGR4為miR-193a-3p的靶基因。我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-193a-3p上調LGR4表達，這有助于促進成骨細胞分化。此外，我們還闡明了miR-193a-3p抑制誘導的成骨細胞分化與ATF4表達的上調有關，證實了LGR4/ATF4信號在成骨細胞分化中的重要性。ATF4是通過誘導骨鈣素、骨唾液蛋白和膠原的表達來調節(jié)成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，有助于骨形成[14]。 因此，我們的研究提示了調節(jié)LGR4/ATF4信號的潛在靶點，并強調了miR-193a-3p/LGR4/ATF4軸在調節(jié)成骨細胞分化中的重要作用?？傊?，我們的結果表明，抑制miR-193a-3p通過上調LGR4/ATF4信號促進BMSCs成骨細胞分化，靶向miR-193a-3p激活LGR4/ATF4信號可能是改善骨形成和防止骨質疏松等骨疾病中一種有用的方法。