劉 婷，李 洋，石志紅

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院涉外病房，陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710061)

肺癌是高發(fā)病率與高死亡率的惡性腫瘤之一，被診斷為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者比例約占80%[1]。多數(shù)NSCLC患者被確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展為NSCLC晚期，臨床上所采用放化療、免疫治療或者靶向藥物治療，雖然能夠讓部分患者的生存時(shí)間延長(zhǎng)，但是大部分患者預(yù)后仍舊不理想[2-3]。燈盞花別名地頂草或東菊，《云南中草藥》中記載燈盞花甘、性溫，具有散寒解表、止痛和舒筋等功效，可用于跌打損傷、瘧疾、腦血栓形成、腦出血和風(fēng)濕痛等疾病治療[4]。燈盞花素(Breviscapine,BVP)是燈盞花的主要提取成分之一，在抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抑制血小板聚集以及調(diào)節(jié)機(jī)體微循環(huán)系統(tǒng)具有重要作用。既往研究[5-6]顯示BVP在胃癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。也有學(xué)者提出BVP在肺癌中存在作用[7]，但是其中的具體作用機(jī)制尚不清楚。本文通過不同濃度BVP處理非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞來探索BVPA549細(xì)胞的增殖及凋亡的影響，為臨床治療NSCLC方案選擇提供試驗(yàn)參考意見。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus)，96孔板、12孔板、6孔板(Thermo Fisher Scientific)，超低溫冰箱(Thermo Scientific)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo Electron)、流式細(xì)胞儀(Becton Dikinson)，紫外分光光度計(jì)(讓奇儀器科技有限公司)，切片機(jī)(萊卡)，高速離心機(jī)(Thermo)。試劑：BVP(南京藥業(yè)有限公司)，兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Ki67、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)、天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、p21抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二甲亞砜、MTT(Sigma)。材料：非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，購(gòu)于上海一研究生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法 將非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞置于含有青霉素、鏈霉素各100 U/ml的完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)。A549細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)則進(jìn)行傳代，制成細(xì)胞懸液。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞于超凈臺(tái)中制成2×104/ml的細(xì)胞懸液，接種在96孔板中，200 μl/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、BVP低劑量組(20 μmol/L)、BVP中劑量組(40 μmol/L)、BVP高劑量組(80 μmol/L)，每組6個(gè)重復(fù)孔，低劑量組、中劑量組、高劑量組均加入BVP，并使其最終濃度分別為20、40、80 μmol/L，對(duì)照組加入等劑量的DMSO。各組細(xì)胞在培養(yǎng)12、24、48 h后棄培養(yǎng)液，加20 μl的MTT溶液，培養(yǎng)2 h，棄MTT溶液，加入150 μl DMSO，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，細(xì)胞存活率=處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取1.3中BVP處理24 h細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，然后加入300 μl緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V/FITC、10 μl PI混合均勻，室溫避光孵育15 min，上樣流式細(xì)胞儀。

1.5 Western-blot檢測(cè) 提取各1.3中BVP處理24 h細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，密封1 h，加入Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Ki67、PCNA、CyclinD1、p21一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，采用TBST漂洗PVDF膜40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1.5 h，參照ECL試劑盒操作說明進(jìn)行顯影與定影，觀察膜上蛋白條帶，收集影像。

2 結(jié) 果

2.1 燈盞花素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 見表1。在處理時(shí)間相同時(shí)，A549細(xì)胞存活率隨著BVP濃度的增加而降低；在相同BVP濃度處理下，A549細(xì)胞存活率隨著BVP作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低(P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞存活率比較(%)

2.2 燈盞花素對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白水平的影響 見表2。BVP低劑量組、BVP中劑量組和BVP高劑量組細(xì)胞的Ki67、PCNA、Cyclin D1蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)，p21表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)，存在劑量效應(yīng)(P<0.05)。

表2 各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白水平比較

2.3 燈盞花素對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 見表3。BVP低劑量組、BVP中劑量組和BVP高劑量組細(xì)胞的凋亡率均高于對(duì)照組(P<0.05)，存在劑量效應(yīng)(P<0.05)；BVP低劑量組、BVP中劑量組和BVP高劑量組Bax、Caspase-9與Caspase-3蛋白水平高于對(duì)照組(P<0.05)，而Bcl-2蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.05)，存在劑量效應(yīng)。

表3 各組細(xì)胞凋亡率及相關(guān)蛋白水平比較

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌屬于一種肺部惡性腫瘤性疾病，發(fā)病起源于支氣管黏膜、支氣管腺體和肺泡上皮，顯微鏡下核異形、細(xì)胞變大和胞漿豐富等特點(diǎn)[8]。我國(guó)非小細(xì)胞肺癌病例占據(jù)肺癌四成以上，早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療對(duì)提高肺癌患者的治愈率及5年生存率至關(guān)重要。目前非小細(xì)胞肺癌主要治療方式有手術(shù)、化療、放療、局部介入治療、分子靶向治療以及中醫(yī)中藥治療等[9]，雖然放化療方式可以使部分患者病情得到改善，但是長(zhǎng)期化療、放療對(duì)患者機(jī)體仍可產(chǎn)生不可忽視的不良反應(yīng)，不利于患者自身免疫力提高，并可能逐漸出現(xiàn)腫瘤耐藥。中醫(yī)中藥在惡性腫瘤治療過程的不良反應(yīng)少的優(yōu)勢(shì)已逐漸受到大眾認(rèn)可[10]，BVP是燈盞花中的黃酮類成分，其包括燈盞甲素與燈盞乙素，臨床上主要將BVP用于治療高血壓、腦血管缺血、心血管等疾病并且臨床療效較好。此外，動(dòng)物體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究顯示BVP具有心血管藥物的作用，例如抗血小板聚集、抗凝血、抗血栓形成、增強(qiáng)機(jī)體清除自由基能力以及改善機(jī)體微循環(huán)的作用。近年研究顯示BVP在腫瘤生長(zhǎng)與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為方面具有一定的抑制作用。Ke等[11]研究報(bào)道顯示，BVP能夠降低肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力，主要是通過抑制STAT3/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果顯示，BVP能夠降低A549細(xì)胞的存活率且存在劑量效應(yīng)，采取Western-blot檢測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示BVP能夠降低A549細(xì)胞中的Ki67、PCNA、Cyclin D1蛋白含量，并且增加p21蛋白水平。Cyclin D1能夠與細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)結(jié)合參與細(xì)胞周期，其可以在G1期迅速合成，在進(jìn)入S期時(shí)開始降解[12]。PCNA是一種促進(jìn)DNA延伸的核蛋白，在真核生物細(xì)胞中的DNA復(fù)制具有重要作用[13]。Ki-67是一種增殖細(xì)胞核抗原，能夠反映細(xì)胞增殖情況，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期時(shí)其蛋白含量增加[14-15]。在細(xì)胞增殖的過程中除了周期蛋白、增殖細(xì)胞核抗原的參與，還存在一類細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)參與細(xì)胞增殖過程。CKI能夠與CDK結(jié)合并抑制CDK活性，來保證細(xì)胞周期的高度時(shí)序性，因此CKI在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期中起著負(fù)調(diào)控作用。p21是CKI家族成員之一，它能與PNCA結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA合成的抑制作用[16]。Guan等[17]研究結(jié)果顯示BVP可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的DNA損傷，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制作用與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。本研究結(jié)果與前人結(jié)果的趨勢(shì)相似，提示BVP可能是通過增加p21蛋白水平，使p21與PNCA結(jié)合增加而抑制DNA合成；同時(shí)還可能增加CKI與CDK結(jié)合，抑制CDK的活性以致Cyclin D1/CDK結(jié)合受到影響，不能使A549細(xì)胞快速?gòu)腉1期到S期的轉(zhuǎn)換，從而降低Ki-67蛋白含量，阻滯了A549細(xì)胞周期，延緩了細(xì)胞分裂進(jìn)程，最終影響到非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡在細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程中具有重要意義，細(xì)胞存活率的降低不僅細(xì)胞增殖能力降低，還存在細(xì)胞凋亡率增加的可能。本研究結(jié)果顯示BVP能夠增加非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，同時(shí)與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的Western-blot檢測(cè)顯示Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量增加，而Bcl-2蛋白水平降低。Bax是促凋亡基因，而Bcl-2是抗凋亡基因，Bax、Bcl-2拮抗調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bax、Bcl-2比例情況決定著細(xì)胞凋亡狀態(tài)[18-20]。Caspase-3是各種凋亡途徑的靶蛋白，凋亡途徑中的信號(hào)被激活后，會(huì)促使Caspase蛋白家族表達(dá)水平發(fā)生改變，經(jīng)Caspase-3蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。Bax是線粒體膜的成分之一，其含量增加能夠使Cyt-C穿過線粒體膜進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡程序起始的Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，促使細(xì)胞凋亡[22]。孫蕾等[23]研究顯示BVP可以通過上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)來增加A549細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與前人研究相似，表明BVP可能是通過增加Bax蛋白水平，降低Bcl-2蛋白含量，激活Caspase-9、Caspase-3活性，進(jìn)而促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

綜上所述，BVP可以通過上調(diào)p21蛋白表達(dá)量，下調(diào)PNCA、CyclinD1、Ki-67蛋白含量，阻滯細(xì)胞周期，從而使細(xì)胞增殖受到抑制；BVP可以通過增加Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平，降低Bcl-2含量，從而促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。但是BVP是通過何種途徑調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的詳細(xì)機(jī)制還需要更深層次研究。