林增海，陸 軍，王凱松

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 汕頭 515041)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第3位[1]。CRC早期缺乏明顯癥狀，一旦出現(xiàn)便血、腹痛等癥狀，病程已經(jīng)達(dá)到中晚期，臨床主要采用手術(shù)聯(lián)合放化療清除病灶組織，延長患者生存期，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[2]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是臨床常用的CRC化療藥物之一，可以有效殺滅或抑制消化道腫瘤細(xì)胞，但其長期應(yīng)用可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，導(dǎo)致臨床治療失敗[3]。分析CRC的發(fā)病機(jī)制，從天然植物中尋找有效的抗癌藥物，受到了研究者們的廣泛關(guān)注。槲皮素(Quercetin，Que)是一種廣泛存在于天然植物中的黃酮類化合物，具有多種生物學(xué)功能，包括抗氧化、抗菌、抗炎、降血壓等，可以延緩衰老，在心血管疾病的防治中具有重要應(yīng)用價值[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Que具有抗腫瘤作用，可以抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡，還可以逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥性，協(xié)同抑制多種惡性腫瘤的生長[5-6]。但Que對CRC的作用及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究探討了Que對5-FU誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞耐藥及自噬的調(diào)控機(jī)制，旨在為Que在CRC治療中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 多功能酶標(biāo)檢測儀(iMark680)購自美國Bio-Rad公司；熒光顯微鏡(IX73型)購自日本Olympus公司；SW480細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；5-FU(批號F6627，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)、Que(批號87K0744，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購自美國Sigma公司；MTT、TUNEL檢測試劑盒均購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；兔抗人p糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(Multidrug resistance associated protein 1，MRP1)、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2抗體(ATP-binding transporter G cassette transporer G2，ABCG2)、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、絲/蘇氨酸激酶(silk/threonine kinase，AKT)、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR單克隆抗體，均購于美國Santa Cruz公司；β-actin和辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG，購于丹麥DAKO公司。

1.2 5-FU耐藥細(xì)胞株建立 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液接種SW480細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。采用濃度遞增誘導(dǎo)法建立5-FU耐藥細(xì)胞株，取對數(shù)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加入5-FU溶液(終濃度為10 μg/ml)，培養(yǎng)過夜，而后加入濃度遞增的5-FU(每次增加10 μg/ml)，反復(fù)處理細(xì)胞，直到細(xì)胞能耐受最大5-FU濃度(40 μg/ml)，則耐藥細(xì)胞株SW480/5-FU構(gòu)建成功。

1.3 SW480/5-FU細(xì)胞株的耐藥性檢測 取對數(shù)生長期SW480和耐藥株SW480/5-FU細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，兩組均加入含5-FU(終濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80、160和320 μg/ml)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜作用30 min，全自動酶標(biāo)儀檢測490 nm波長吸光度值，分析半抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration，IC50)，計(jì)算細(xì)胞的耐藥指數(shù)(Resistance index，RI)=IC50(SW480/5-FU)/IC50(SW480)。

1.4 Que的劑量篩選和分組 取對數(shù)生長期耐藥株SW480/5-FU細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，兩組均加入Que(終濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，MTT法檢測各組細(xì)胞抑制率。設(shè)置Que高、中、低劑量組(10、20、40 μmol/L)和對照組(0 μmol/L)。

1.5 Que對耐藥株SW480/5-FU細(xì)胞5-FU耐藥性的影響 取各組與相應(yīng)藥物孵育24 h的SW480/5-FU細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以1×105個/ml接種于96孔板，加入含5-FU(終濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80、160和320 μg/ml)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT法檢測各組細(xì)胞的IC50，計(jì)算耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=Que干預(yù)前IC50/Que干預(yù)后IC50。

1.6 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡 取各組與相應(yīng)藥物孵育24 h的SW480/5-FU細(xì)胞，制作細(xì)胞涂片。經(jīng)4%多聚甲醛固定后，依次分別進(jìn)行TUNEL染色，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡率，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明操作染色。

1.7 免疫熒光檢測細(xì)胞自噬活性 取各組與相應(yīng)藥物孵育48 h的SW480/5-FU細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的甲醛固定10 min，200 μl的Triton-X室溫通透30 min，3%的BSA封閉1 h，加入一抗(LC3，稀釋比例1∶400)孵育過夜，加入熒光耦聯(lián)二抗，37 ℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)。

1.8 Western blot檢測細(xì)胞耐藥和自噬相關(guān)蛋白以及AKT/mTOR的磷酸化 取各組與相應(yīng)藥物孵育24 h的SW480/5-FU細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加一抗(P-gp、MRP1、ABCG2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62、AKT、p-AKT、mTOR、mTOR，稀釋比例均為1∶1000，β-actin為內(nèi)參)，4 ℃孵育過夜，洗膜加二抗(稀釋比例為1∶5000)，室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光顯影，分析對比條帶強(qiáng)弱。

2 結(jié) 果

2.1 SW480/5-FU細(xì)胞的5-FU耐藥性 MTT結(jié)果顯示(圖1)，5-FU對SW480細(xì)胞和SW480/5-FU細(xì)胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性，IC50分別為(32.20±5.71)μg/ml和(442.34±56.41)μg/ml。5-FU抑制SW480/5-FU細(xì)胞的IC50明顯高于SW480細(xì)胞(P<0.05)，RI=13.74。

圖1 SW480/5-FU細(xì)胞的5-FU耐藥性

2.2 Que對SW480/5-FU細(xì)胞增殖活性的影響 MTT結(jié)果顯示(圖2)，Que對SW480/5-FU細(xì)胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性，隨著Que濃度增加，當(dāng)Que濃度為20 μmol/L時，細(xì)胞抑制率明顯升高(P<0.05)。因此，設(shè)置Que低、中、高劑量組的濃度分別為10、20、40 μmol/L。

注：與0 μmol/L Que作用相比，*P<0.05

2.3 Que對SW480/5-FU細(xì)胞耐藥性的影響 MTT結(jié)果顯示(圖3)，與對照組相比，Que中、高劑量組5-FU抑制SW480/5-FU細(xì)胞的IC50明顯下降(P<0.05)，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.27、4.03。

注：與對照組相比，*P<0.05

2.4 Que對SW480/5-FU細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示(圖4)，與對照組相比，Que中、高劑量組SW480/5-FU細(xì)胞的P-gp、MRP1、ABCG2蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。

1：對照組；2：Que低劑量組；3：Que中劑量組；4：Que高劑量組。與對照組相比，*P<0.05

2.5 Que對SW480/5-FU細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示(圖5)，與對照組相比，Que中、高劑量組SW480/5-FU細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。

2.6 Que對SW480/5-FU細(xì)胞自噬活性及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示(圖6)，與對照組相比，Que中、高劑量組SW480/5-FU細(xì)胞的自噬活性明顯增強(qiáng)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)明顯升高，p62蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。

圖5 Que對SW480/5-FU細(xì)胞凋亡的影響

A：免疫熒光檢測細(xì)胞自噬活性；B：Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。1：對照組；2：Que低劑量組；3：Que中劑量組；4：Que高劑量組。與對照組相比，*P<0.05

2.7 Que對SW480/5-FU細(xì)胞AKT/mTOR磷酸化的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示(圖7)，與對照組相比，Que中、高劑量組SW480/5-FU細(xì)胞p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。

1：對照組；2：Que低劑量組；3：Que中劑量組；4：Que高劑量組。與對照組相比，*P<0.05

3 討 論

CRC起源于結(jié)直腸黏膜上皮，早期無典型癥狀，隨病情進(jìn)展，可出現(xiàn)腹瀉、便血、局部腹痛等，臨床主要采用手術(shù)聯(lián)合放化療[7]。5-FU是臨床常用的CRC化療藥物之一，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其長期應(yīng)用可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞耐藥，導(dǎo)致臨床治療失敗[8]。Que是一種天然化合物，可以作用于CRC的發(fā)生和進(jìn)展階段，發(fā)揮抗腫瘤作用，還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性，抑制多種CRC的發(fā)生發(fā)展[9-10]。本研究中，5-FU對SW480細(xì)胞和SW480/5-FU細(xì)胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性，5-FU抑制SW480/5-FU細(xì)胞的IC50明顯高于SW480細(xì)胞，RI為13.74，提示SW480/5-FU細(xì)胞株對5-FU表現(xiàn)出明顯的耐藥性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。本研究中，Que對SW480/5-FU細(xì)胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性，隨著Que濃度增加，當(dāng)Que濃度為20 μmol/L時，細(xì)胞抑制率和凋亡率明顯升高。Feng等[11]研究顯示，Que可以抑制SW480細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果與其類似，提示Que可以以劑量依賴性的方式抑制5-FU誘導(dǎo)耐藥SW480細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可用于臨床輔助治療。研究顯示[12-13]，Que可以參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性、自噬、凋亡等多種信號通路蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本研究進(jìn)一步分析Que對SW480細(xì)胞的5-FU耐藥性和自噬的影響，旨在為Que的臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

本研究中，與對照組相比，Que中、高劑量組5-FU抑制SW480/5-FU細(xì)胞的IC50明顯下降，且低、中、高劑量Que對SW480/5-FU細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.08、2.27和4.03，提示Que可以以劑量依賴性的方式逆轉(zhuǎn)SW480/5-FU細(xì)胞的耐藥性。本研究中，與對照組相比，Que中、高劑量組SW480/5-FU細(xì)胞的P-gp、MRP1、ABCG2蛋白表達(dá)明顯下降。P-gp、MRP1、ABCG2均為腫瘤細(xì)胞常見的多藥耐藥蛋白，其表達(dá)上調(diào)可以通過降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，抑制化療藥物的毒性作用等，提高腫瘤細(xì)胞對化療耐藥的耐受性[14-15]。何海蘭等[16]研究顯示，Que可以抑制P-gp和MRP1表達(dá)，逆轉(zhuǎn)SW480對奧沙利鉑的耐藥性，提示Que以劑量依賴性的方式下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1、ABCG2的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)SW480/5-FU細(xì)胞的耐藥性。

自噬是一種不依賴Caspase的細(xì)胞死亡途徑，可以與溶酶體融合，清除細(xì)胞內(nèi)的多余蛋白、損傷細(xì)胞器，在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[17]。本研究中，與對照組相比，Que中、高劑量組SW480/5-FU細(xì)胞的自噬活性明顯增強(qiáng)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)均明顯升高，p62蛋白表達(dá)明顯下降，提示Que可以呈劑量依賴性的促進(jìn)細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)，抑制p62蛋白表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的自噬活性。LC3是一種自噬體標(biāo)志蛋白，在自噬過程中，LC3Ⅰ會被修飾和加工為一種膜結(jié)合形式即LC3Ⅱ，并定位到自噬小體，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可以很好的反映細(xì)胞的自噬活性[18]，提示Que可以呈劑量依賴性的增強(qiáng)SW480/5-FU細(xì)胞自噬活性。p62是細(xì)胞自噬的特異性降解底物，可以與LC3相互作用，并通過自噬-溶酶體系統(tǒng)降解，其表達(dá)水平可以反映細(xì)胞的自噬活性[19]，提示Que可以抑制SW480/5-FU細(xì)胞的自噬降解，進(jìn)一步促進(jìn)自噬。Wang等[20]的研究顯示，Que可以促進(jìn)LC3Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡和凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，提示Que可以通過增強(qiáng)SW480/5-FU細(xì)胞自噬活性，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，有望應(yīng)用于臨床抗腫瘤輔助治療。Huang等[21]研究顯示，腫瘤細(xì)胞化療耐藥性與細(xì)胞的過度自噬有關(guān)，熱激因子1、氧自由基等介導(dǎo)的過度自噬可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥，而過度的自噬亦可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Met等表達(dá)，逆轉(zhuǎn)耐藥性，提示Que可以通過增強(qiáng)SW480/5-FU細(xì)胞自噬活性，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性，但其具體的作用及機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Que中、高劑量組SW480/5-FU細(xì)胞內(nèi)AKT和mTOR的磷酸化水平明顯下降。AKT/mTOR信號通路是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的重要信號通路[22]。Lan等[23]研究顯示，Que可以抑制AKT/mTOR的磷酸化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡，提示Que誘導(dǎo)SW480/5-FU細(xì)胞的自噬性死亡可能與被抑制的AKT/mTOR信號通路有關(guān)。

綜上所述，Que可以以劑量依賴性的方式抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，逆轉(zhuǎn)SW480/5-FU細(xì)胞的5-FU耐藥性，還可以誘導(dǎo)SW480/5-FU細(xì)胞的自噬性死亡，其作用機(jī)制可能與被抑制的AKT/mTOR信號通路有關(guān)，有望應(yīng)用于臨床治療。但本研究尚處于初步探索階段，其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。