李 娜，王瑞輝，郭 婕，李 華，郭新榮，張容超，吳 濤

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是目前神經(jīng)外科臨床最常見(jiàn)的疾病之一，隨著社會(huì)的發(fā)展變化，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的特點(diǎn)；又因其致死率高、致殘率高、患病人群多為中青年，給家庭和社會(huì)帶來(lái)很大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。TBI 后腦神經(jīng)細(xì)胞的生理病理變化過(guò)程十分復(fù)雜，主要包括神經(jīng)細(xì)胞死亡[1]、腦水腫[2]、氧化應(yīng)激[3]、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)毒性釋放[4]、神經(jīng)炎癥[5]、血腦屏障障礙[6]等。其中TBI后血腦屏障破壞、凝血功能障礙、氧化應(yīng)激等因素可引起的炎癥反應(yīng)是引起TBI后腦水腫的主要原因[7]，有效的控制腦神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和腦水腫對(duì)TBI患者的預(yù)后及康復(fù)起著重要的作用[8]。本研究主要探討電針對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠血清及大腦組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL-1β、IL-6)等表達(dá)及神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)SD大鼠66 只(雄性，6～8周齡)，體重180～220 g，購(gòu)買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2018-001]。將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在陜西中醫(yī)藥大學(xué)針?biāo)幗Y(jié)合動(dòng)物飼養(yǎng)中心進(jìn)行分籠喂養(yǎng)，濕度(54±2)%，溫度(23±3)℃，晝夜節(jié)律12 h/12 h，自由飲水?dāng)z食。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組12只、假手術(shù)組12只、模型組21 只及電針組21只，正常對(duì)照組和假手術(shù)組每組6只用于腦含水量測(cè)定，其余6只用于Elisa和Western blot檢測(cè)，電針組、模型組再需根據(jù)干預(yù)和取材時(shí)間的不同，又分為1、3、7 d 3個(gè)亞組(每亞組7 只)。

1.2 造模方法 在大鼠左側(cè)頂葉采用改良 Feeney’s自由落體打擊法[9]進(jìn)行TBI 模型制備。假手術(shù)組、電針組及模型組大鼠三組均進(jìn)行術(shù)前麻醉，麻醉劑量為：10%水合氯醛(3.8 ml/kg)，腹腔注射，麻醉起效后，剔除施術(shù)部位毛發(fā)后，將大鼠固定于腦立體定位儀上，以頭部正中線中點(diǎn)左側(cè) 0.5 cm 處為中心，縱行切開(kāi)頭部皮膚 1.5 cm。使施術(shù)部位顱骨充分暴露后，用電磨鉆鉆一直徑 5 mm 的小孔，坐標(biāo)位置：冠狀縫后0.6 cm、矢狀縫左側(cè)旁開(kāi)0.5 cm，將20 g砝碼從50 cm高的透明玻璃管孔上端垂直下落擊打小孔，制備大鼠左側(cè)大腦頂葉TBI中度顱腦損傷模型。待大鼠蘇醒后，對(duì)造模大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，量表使用改良神經(jīng)功能缺損量表(Modified neurological severity scale，mNSS)，以評(píng)定大鼠即時(shí)神經(jīng)功能，評(píng)分為 7～12 分，則認(rèn)定為造模成功。造模后連續(xù)3 d，腹腔注射慶大霉素(0.2 ml/kg)以抗感染。假手術(shù)組大鼠只開(kāi)顱鉆孔，不打擊。造模過(guò)程中和造模后，大鼠共死亡6只(電針組3只，模型組3只)。

1.3 干預(yù)方法 本實(shí)驗(yàn)采用電針進(jìn)行干預(yù)，穴位選取參照《大鼠穴位圖譜的研制》[10]，選取“水溝”“百會(huì)”，雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”“足三里”穴，于造模后 24 h對(duì)電針組進(jìn)行電針干預(yù)。選用一次性針灸針(規(guī)格：0.30 mm×25 mm)，“百會(huì)”穴：斜刺，深度為2 mm,“水溝”穴：點(diǎn)刺 30 s，深度為1 mm；“內(nèi)關(guān)”穴，直刺，深度為 1 mm， “足三里”穴：直刺，深度為 7 mm；針刺得氣后，“足三里”和“內(nèi)關(guān)”穴接連電針，波形為：斷續(xù)波，頻率為：2 Hz，留針15 min；1次/d，不同亞組分別干預(yù)1、3、7 d。模型組和假手術(shù)組，兩組大鼠每天模擬針刺前的操作：抓取、固定 15 min，正常對(duì)照組不進(jìn)行干預(yù)。

1.4 主要試劑與儀器 大鼠TNF-α抗體、 IL-6抗體、IL-1β抗體購(gòu)自博士德生物工程公司，批號(hào)分別為：PB0082、PB0061、PB0055)；羊抗兔 IgG(H+L)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為：A0208；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒購(gòu)于博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為:EK0421、EK0526、EK0393)；水合氯醛購(gòu)于上海山浦化工有限公司；SDZ-Ⅱ電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，腦立體定位儀(成都泰萌軟件有限公司)，SpectraMax5 酶標(biāo)儀(美國(guó) Molecular Devices 公司)。

1.5 行為學(xué)檢測(cè) 采用改良神經(jīng)功能缺損量表(mNSS )[11]進(jìn)行大鼠的神經(jīng)功能的評(píng)估。每組大鼠均根據(jù)神經(jīng)功能缺損量表進(jìn)行運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和平衡訓(xùn)練，并于術(shù)后 1、3 、5、7 d 記錄其mNSS 評(píng)分，分別從4 個(gè)方面：運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡、反射進(jìn)行神經(jīng)功能綜合評(píng)估。總分 共18 分，評(píng)分越高(低)代表神經(jīng)功能損傷程度越重(輕)，0 分為完全正常。

1.6 大鼠腦組織含水量檢測(cè) 采用干濕重法測(cè)定腦組織含水量[12]，每組于第3天隨機(jī)選取6只大鼠斷頭處死，取左側(cè)腦組織，電子天平(精確度 0.1 mg)測(cè)得濕重，然后置于70 ℃的烤箱內(nèi)烘干48 h，恢復(fù)室溫后，測(cè)得干重。腦組織水含量=(濕重-干重) /濕重×100%[12]。

1.7 炎癥因子表達(dá)檢測(cè) 大鼠10%水合氯醛(3.8 ml/kg)腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈取血，室溫凝固2 h，離心15 min (3000 r/min)，收集血清待測(cè)。嚴(yán)格按照武漢博士德生物有限公司炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 試劑盒的說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行操作。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)損傷腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá) 取損傷腦組織樣本100 mg，加 500 μl含蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液后進(jìn)行勻漿，提取總蛋白，金屬浴 95 ℃變性5 min。SDS-PAGE(12%) 凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用脫脂奶粉(5%)封閉 2 h后，一抗孵育(4 ℃過(guò)夜)，抗體稀釋比例為：TNF-α 1∶2000，IL-6 1∶1000，IL-1β 1∶1000，β-actin 1∶1000；孵育二抗。滴加發(fā)光液，ECL 發(fā)光成像系統(tǒng)曝光拍照，計(jì)算并分析各目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的一般情況比較 見(jiàn)表1～3。正常對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間精神狀態(tài)良好、毛色光滑、反應(yīng)靈活、自主飲水飲食、食量無(wú)減少，體重明顯增加；模型組大鼠手術(shù)后1～3 d，可見(jiàn)精神懶惰，飲食量明顯減少，體重減輕；電針組大鼠術(shù)后1～3 d在食量和體重方面有所減少；3～7 d模型組、電針組大鼠在飲食、飲水、體重增加均有所好轉(zhuǎn)，電針組較模型組明顯好轉(zhuǎn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 四組大鼠飲食量比較(g/d)

表2 四組大鼠飲水量比較(ml/d)

表3 四組大鼠體重比較(g/d)

2.2 各組大鼠行為學(xué)比較 見(jiàn)表4。各組大鼠在造模前mNSS評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，電針組和模型組在造模后 6 h、1 d mNSS評(píng)分相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；電針治療后(3 d、7 d)，與模型組相比較，電針組mNSS評(píng)分降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表4 各組大鼠電針干預(yù)后mNSS評(píng)分比較(分)

2.3 各組腦組織水含量比較 相比較于正常對(duì)照組，假手術(shù)組的大鼠腦組織含水量較低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);相比較于假手術(shù)組，模型組大鼠損傷腦組織含水量升高明顯(P<0.05)；相比較于模型組，電針組大鼠損傷腦組織含水量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 四組大鼠TBI后3 d腦組織水含量比較(%)

2.4 各組大鼠血清炎癥因子指標(biāo)比較 相比于正常對(duì)照組，假手術(shù)組大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量略有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),相比于假手術(shù)組，模型組大鼠血清炎癥因子(模型組)IL-1β、IL-6、TNF-α的含量顯著升高(P<0.05);相比于模型組，電針組大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量明顯降低。見(jiàn)表6。

2.5 各組大鼠損傷腦組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)量的比較 Western blot 法檢測(cè)顯示，相比于正常對(duì)照組，假手術(shù)組大鼠大腦組織中TNF-α蛋白表達(dá)量有所升高(1 d，P<0.05，7 d，P>0.05)；相比于假手術(shù)組，模型組大鼠1、7 d 時(shí)損傷腦組織TNF-α蛋白表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)；相比于模型組，電針組大鼠電針干預(yù)后損傷腦組織TNF-α表達(dá)量有所升高(1 d，P>0.05),表達(dá)量降低(7 d，P<0.05)；大鼠大腦組織IL-6在術(shù)后1、7 d蛋白量表達(dá)，相比于假手術(shù)組，正常對(duì)照組表達(dá)量較低(P<0.05)，模型組表達(dá)量升高較為明顯(P<0.05)；相比于模型組，電針組大鼠電針干預(yù)后1 d腦組織IL-6表達(dá)量有所增加，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干預(yù)7 d大腦組織IL-6表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；大鼠大腦組織IL-1β在術(shù)后1、7 d蛋白量表達(dá)，相比于假手術(shù)組，模型組表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；相比于模型組，電針組大鼠腦組織IL-1β表達(dá)量降低較明顯(圖1)。

表6 各組大鼠干預(yù)后血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量比較(pg/ml)

注：術(shù)后1 d、7 d各組損傷大腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)情況(A圖、B圖)，術(shù)后1 d、7 d各組損傷大腦組織TNF-α含量比較(C圖),術(shù)后1 d、7 d各組損傷大腦組織IL-6含量比較(D圖),術(shù)后1 d、7 d各組損傷腦組織IL-1β含量比較(E圖)。

3 討 論

TBI的損傷一般分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，其中原發(fā)性損傷為機(jī)械外力所造成的腦組織結(jié)構(gòu)損傷，是外力對(duì)腦組織的直接損傷，具有不可控性；繼發(fā)性損傷是從原發(fā)性損傷開(kāi)始時(shí)起，腦部組織、血管等由于微環(huán)境的變化所引起的病理生理過(guò)程。根據(jù)原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的特點(diǎn)，學(xué)界認(rèn)為有效控制繼發(fā)性損傷是決定顱腦損傷患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵。顱腦損傷發(fā)生后，以腦水腫、神經(jīng)炎癥為代表的繼發(fā)性腦損傷是影響TBI患者康復(fù)的重要因素之一，但目前尚無(wú)有效治療方案[13]。

TBI后腦組織局部受損，局部及全身的炎癥反應(yīng)迅速被激活，小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞首先被激活，進(jìn)而產(chǎn)生大量如：TNF-α、IL-6等炎性因子,激活后的炎性細(xì)胞進(jìn)入腦組織后可以再次重新釋放炎癥因子，導(dǎo)致血腦屏障破壞,誘發(fā)腦水腫,導(dǎo)致顱腦損傷[14-15]。研究表明，在顱腦損傷后，血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 等與腦內(nèi)及全身炎癥密切相關(guān)的炎癥因子水平明顯升高[16-17]。

針灸作為中國(guó)傳統(tǒng)特色療法之一，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中療效顯著。TBI作為神經(jīng)外科常見(jiàn)病、多發(fā)病，針灸對(duì)其治療和研究中，選取優(yōu)勢(shì)穴位“百會(huì)、水溝、內(nèi)關(guān)、足三里”等穴位，或結(jié)合藥物、穴位注射、神經(jīng)肌肉電刺激、高壓氧、康復(fù)訓(xùn)練等，在改善TBI后神經(jīng)功能、認(rèn)知功能、昏迷等方面具有良好的臨床療效[18-20]。由于TBI的病理生理過(guò)程較為復(fù)雜，對(duì)其針灸作用機(jī)制的研究目前還處于初步階段，研究表明，在TBI繼發(fā)性損傷早期的炎癥反應(yīng)中，白細(xì)胞介素和TNF-α 在其中起著非常重要的作用，而中醫(yī)針灸能明顯減少炎癥因子在大腦組織中的含量，抑制大腦水腫，發(fā)揮有效保護(hù)神經(jīng)元作用[21]。

本研究從電針對(duì)顱腦損傷后炎癥因子及蛋白的表達(dá)入手，選取腦損傷急性期的1、7 d為時(shí)間點(diǎn)，觀察各組大鼠腦組織及血清中炎癥因子及蛋白的表達(dá)的情況。結(jié)果顯示：在早期，損傷大腦組織及血清中的炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)急劇升高，而后逐漸降低，在治療7 d后表達(dá)水平有所降低，而且，電針組TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)量均明顯低于相同時(shí)間段的模型組，這與行為學(xué)等檢測(cè)結(jié)果變化是一致的。因此，電針“百會(huì)、水溝、內(nèi)關(guān)、足三里”穴可明顯改善創(chuàng)傷型顱腦損傷大鼠的神經(jīng)功能，減輕損傷大腦組織的炎癥反應(yīng)，其相關(guān)機(jī)制可能與下調(diào)損傷大腦組織及血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，改善腦水腫有關(guān)。