董 燁，張益奇，2，3，姚洪正，何光喜，戴志遠(yuǎn)，2，3*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310035 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310035 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連116000 4 杭州千島湖發(fā)展集團(tuán)有限公司 杭州311701）

水產(chǎn)加工過(guò)程中通常產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，如魚鱗、魚鰭、魚皮、魚骨及內(nèi)臟等，約占活魚體重的50%～70%[1-2]，其中，魚骨含有豐富的膠原蛋白、鈣和磷等營(yíng)養(yǎng)成分。然而，魚骨質(zhì)構(gòu)堅(jiān)硬，內(nèi)部的膠原蛋白由3 條螺旋鏈纏繞而成，基質(zhì)附著羥基磷灰石，較難利用[3]。我國(guó)目前對(duì)魚骨的開(kāi)發(fā)利用技術(shù)較為落后，大多數(shù)被直接丟棄，導(dǎo)致環(huán)境問(wèn)題和寶貴營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)。利用一些新技術(shù)手段對(duì)這些低值魚骨進(jìn)行高值化、生態(tài)化利用具有一定的意義。

酶解法制備魚類蛋白生物活性物質(zhì)是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，如Garcia-moreno 等[4]研究了不同DH 藍(lán)鱈魚酶解產(chǎn)物的抗氧化活性、ACE 抑制活性和抗原性。Lima 等[5]研究了不同DH 石首魚副產(chǎn)物酶解產(chǎn)物的抗氧化和抗菌活性。李軍等[6]酶解鰱魚骨，分離純化得到具有高抗氧化活性的膠原多肽。水產(chǎn)品加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物通常作為制備酶解產(chǎn)物的來(lái)源。然而，作為副產(chǎn)物之一的魚骨，其內(nèi)部膠原蛋白分子通過(guò)次級(jí)鍵形成穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)，并與羥基磷灰石牢固結(jié)合，包埋了酶的催化位點(diǎn)，導(dǎo)致酶解效率低下。因此亟需探索一些簡(jiǎn)單高效的魚骨預(yù)處理方法。汽爆技術(shù)是一種物理化學(xué)預(yù)處理技術(shù)，可以破壞材料結(jié)構(gòu)，從而提高酶解效率[7]。將原料在高壓蒸汽中保壓一段時(shí)間后瞬時(shí)泄壓，飽和蒸汽急劇膨脹而絕熱做功，產(chǎn)生的沖擊波對(duì)原料進(jìn)行機(jī)械剪切，解離原料組分間的緊密結(jié)構(gòu)[8]。因汽爆技術(shù)投資成本低，能耗低且綠色環(huán)保，在原料預(yù)處理中得到廣泛的應(yīng)用[9-11]。本文以鳙魚骨為原材料，采用汽爆技術(shù)預(yù)處理魚骨，酶解制備不同水解度的魚骨酶解產(chǎn)物，評(píng)估魚骨酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，探究魚骨酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布情況，為魚骨資源高值化的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鳙魚骨，杭州千島湖；中性蛋白酶，源葉生物技術(shù)有限公司；復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶3.0T、風(fēng)味蛋白酶，諾維信公司；木瓜蛋白酶、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、水楊酸、氯化亞鐵、氯化鐵、30%過(guò)氧化氫、95%乙醇、鐵氰化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH、ABTS、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（429 u）、碳酸酐酶（29 ku）、細(xì)胞色素C（12.4 ku）、抑肽酶（6.5 ku）等，美國(guó)Sigma 公司。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

e2695 高效液相色譜，美國(guó)Waters 公司；FE20 pH 計(jì)，梅特勒儀器有限公司；SPECTRA MAX190酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；QBS 200B汽爆機(jī)，正道生物能源公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、Fresco 21 冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；400Y 多功能粉碎機(jī)，永康鉑歐五金制品有限公司；DGG-9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Ultra-Turrax T-18 basic 均質(zhì)機(jī)，德國(guó)IKA 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 汽爆處理[8]用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡魚骨去除雜蛋白，每隔2 h 更換1 次浸泡液，浸泡4 h 后，將魚骨取出洗至中性，瀝干備用。將汽爆機(jī)預(yù)熱，至壓力為0.6 MPa。取200 g 魚骨置汽爆機(jī)內(nèi)，保壓2 min 后瞬間泄壓（前期通過(guò)對(duì)不同汽爆條件魚骨酶解特性的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)汽爆壓力0.6 MPa，保壓時(shí)間2 min 時(shí)，酶解效果較好），收集汽爆后的魚骨置40 ℃干燥箱烘干后粉碎，于-20 ℃保存待用。

1.3.2 酶解試驗(yàn) 采用堿性蛋白酶（50 ℃，pH 8.0）、木瓜蛋白酶（50 ℃，pH 7.0）、復(fù)合蛋白酶（50℃，pH 7.0）、中性蛋白酶（50 ℃，pH 7.0）和風(fēng)味蛋白酶（50 ℃，pH 7.0）5 種蛋白酶，在各自最適條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。將6%汽爆魚骨粉溶液均質(zhì)5 min，水浴加熱至各蛋白酶對(duì)應(yīng)的最適溫度，用0.05 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)至最適pH 值，蛋白酶添量為2%，開(kāi)始反應(yīng)并計(jì)時(shí)，反應(yīng)過(guò)程中滴加0.05 mol/L NaOH 維持蛋白酶的最適pH 值，同時(shí)記錄NaOH 溶液的消耗量。通過(guò)消耗的NaOH 量計(jì)算DH，評(píng)價(jià)各蛋白酶的酶解效果。

1.3.3 水解度（DH）的測(cè)定 采用pH-stat 法[12]測(cè)定水解過(guò)程中的NaOH 消耗量，計(jì)算酶解產(chǎn)物的DH。

式中：B——消耗NaOH 體積，mL；Nb——NaOH 濃度，mol/L；α——α 氨基的解離度；MP——底物中蛋白質(zhì)總量，g；htot——底物中蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)，mmol/g。

1.3.4 不同DH 的魚骨酶解產(chǎn)物的制備 使用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶制備不同DH 的魚骨酶解產(chǎn)物，分別記為HA 和HP。通過(guò)控制NaOH 消耗量來(lái)制備不同DH 的酶解產(chǎn)物。當(dāng)DH 分別達(dá)到5%，10%，15%時(shí)，停止滴加堿液，置沸水浴中滅酶10 min，8 000 r/min 離心15 min，取上清液（分別記為HA5、HA10、HA15、HP5、HP10 和HP15），冷凍干燥，備用。

1.3.5 抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.5.1 DPPH 自由基清除率的測(cè)定 參考Chen等[13]方法，稍作修改。取將1 mL DPPH 溶液（0.15 mmol/L），與1 mL 酶解液混合，室溫（25 ℃）下避光靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定該混合物的吸光度A1，將1 mL 酶解液與1 mL 95%乙醇混合后測(cè)定其吸光度A2，1 mL 超純水與1 mL DPPH 乙醇（95%）混合后測(cè)定其吸光度A3。計(jì)算DPPH 清除率公式：

1.3.5.2 ABTS 自由基清除率的測(cè)定 參考Ketnawa 等[14]方法配制ABTS 母液，于室溫避光反應(yīng)12～16 h，用pH 7.4 的0.2 mol/L PBS 緩沖液稀釋ABTS 母液，使其在波長(zhǎng)734 nm 處的吸光值為0.7±0.02。移取50 μL 樣品與150 μL ABTS 溶液于96 孔酶標(biāo)板上混勻，室溫下避光反應(yīng)6 min后，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光值（A1）。用50 μL超純水代替樣品的反應(yīng)體系為控制組（A2），以150 μL PBS 代替ABTS 溶液的反應(yīng)體系為樣品空白組（A3），以50 μL 超純水和150 μL PBS 緩沖液分別代替樣品和ABTS 溶液的反應(yīng)體系為空白組（A4）。

1.3.5.3 羥基自由基清除率的測(cè)定 參考崔帥[15]的方法，稍作修改。依次加入350 μL 超純水、50 μL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、50 μL 樣品、50 μL 9 mmol/L 的氯化亞鐵溶液、50 μL 8.8 mmol/L過(guò)氧化氫溶液，混勻后于37 ℃保溫15 min，在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)溶液的吸光度。A1為樣品的吸光度；A2為50 μL 超純水代替氯化亞鐵溶液測(cè)得的吸光度；A3為50 μL 超純水代替樣品測(cè)得的吸光度。

1.3.5.4 還原力的測(cè)定 參考賈韶千等[16]的方法，移取200 μL 樣品與500 μL 1%鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃水浴20 min，加入500 μL 10% TCA 終止反應(yīng)。將反應(yīng)液以6 000 r/min 離心5 min，取上清液500 μL 于離心管中，分別加入500 μL 超純水和200 μL 0.1%氯化鐵溶液，搖勻后置50 ℃水浴10 min。取200 μL 溶液于波長(zhǎng)700 nm 處測(cè)定吸光值。將200 μL 超純水代替氯化鐵作為空白對(duì)照。

1.3.6 相對(duì)分子質(zhì)量 參照Z(yǔ)hang 等[17]的方法，采用Waters e2695 高效液相系統(tǒng)，色譜柱為TSKgel G2000 SWxl（7.8 mm×300 mm，Tosoh），UV/Vis 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，洗脫液為45%乙腈-55%水溶液（0.1% TFA），0.5 mL/min 等度洗脫，時(shí)間30 min，進(jìn)樣量10 μL。采用細(xì)胞色素C、碳酸酐酶、抑肽酶和馬尿酰-組氨酰-亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)品。以分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（lgM）為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)作圖，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品相對(duì)分子質(zhì)量分布情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用OriginPro2018 作圖，SPSS 21.0 軟件處理數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用多重比較分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對(duì)鳙魚骨的酶解效果

水解度（DH）可作為肽鍵斷裂的一個(gè)指標(biāo)[18]。不同種類的蛋白酶的底物特異性和作用的酶切位點(diǎn)不同，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物DH 和氨基酸序列不同，從而影響產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、組成和功能[19]。由圖1 可知，DH 隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，在前30 min DH增加較快，隨后逐漸趨于平緩，這可能是由于隨著酶解的進(jìn)行，有效酶切位點(diǎn)逐漸減少。不同蛋白酶對(duì)魚骨的酶解效果差異較大，堿性蛋白酶處理的水解產(chǎn)物的DH 最高，在300 min 時(shí)達(dá)21.03%，其次為復(fù)合蛋白酶，而風(fēng)味蛋白酶處理的酶解產(chǎn)物的DH 最低。最終選擇堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶作為后續(xù)魚骨酶解用酶。

圖1 蛋白酶對(duì)魚骨水解度的影響Fig.1 Effect of proteases on DH of fish bone

2.2 魚骨酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH 是一種大分子自由基，反映酶解產(chǎn)物的自由基清除能力，是評(píng)價(jià)酶解產(chǎn)物體外抗氧化能力的重要指標(biāo)[20]。不同酶的酶解產(chǎn)物的氨基酸序列不同，對(duì)DPPH自由基的清除能力也不同。由圖2 可看出，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物（HA）和復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物（HP）對(duì)DPPH 自由基的清除活性均隨樣品濃度的增加而顯著增加（P＜0.05）。HP 對(duì)DPPH 自由基的清除活性高于HA，這可能是由于復(fù)合蛋白酶獲得的酶解物具有更強(qiáng)的供氫作用，從而對(duì)DPPH 自由基具有更好的清除活性。當(dāng)DH 為10%時(shí)，HP 表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH 自由基清除率，其IC50值為2.85 mg/mL，而HA10 的IC50值為6.67 mg/mL，差異顯著（P＜0.05），表明HP10 中含有較多的抗氧化組分。

圖2 不同水解度魚骨酶解產(chǎn)物的DPPH 自由基清除率Fig.2 DPPH scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

2.2.2 ABTS 自由基清除能力 ABTS 自由基清除法常用于評(píng)價(jià)親水性和親脂性化合物的抗氧化活性[21]。圖3 顯示不同DH 條件下酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力，表明ABTS 自由基清除活性受酶解液濃度的影響，在試驗(yàn)濃度范圍，隨著酶解液濃度的增大，其清除活性增大，具有一定的量效關(guān)系。隨著DH 的增大，兩種酶解物對(duì)ABTS 自由基清除能力呈先增大后減小的趨勢(shì)。HP10 具有較好的ABTS 自由基清除能力，這與DPPH 自由基清除能力的結(jié)果相同。酶解產(chǎn)物清除自由基的能力不僅與肽鏈的分子質(zhì)量大小有關(guān)，還與酶解過(guò)程中所用酶的特異性有關(guān)[22]，在同一DH 下，HP10 的IC50值為0.99 mg/mL，而HA10 的IC50值為1.59 mg/mL，差異顯著（P＜0.05）。從兩種酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基清除能力的IC50值可看出，酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基的清除能力優(yōu)于DPPH 自由基清除能力，這與Latorres 等[23]的研究結(jié)果一致。

圖3 不同水解度魚骨酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除率Fig.3 ABTS scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

2.2.3 羥自由基清除能力 羥基自由基可與生物體內(nèi)的任何物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，特別是與蛋白質(zhì)、DNA和脂類等大分子物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰老、癌癥和一些疾病的發(fā)生[24]，因此，清除羥基自由基對(duì)生物體至關(guān)重要。HA 和HP 不同DH 清除羥基自由基的能力如圖4所示。羥基自由基清除能力與酶解液濃度呈正相關(guān)。當(dāng)酶解液質(zhì)量濃度為6 mg/mL 時(shí)，HA15（54.40%）具有與HP15（54.96%）相似的羥基自由基清除能力。HA 對(duì)羥基自由基的清除能力隨DH 的增加而增加，HA15 的IC50值為7.09 mg/mL，而HP 對(duì)羥基自由基清除能力隨DH 呈先增大后減小趨勢(shì)，這與ABTS 自由基清除能力相似。HP10 羥基自由基清除能力較高，IC50值為4.91 mg/mL，而HA10 的IC50值為8.33 mg/mL，差異顯著（P＜0.05）。

圖4 不同水解度魚骨酶解產(chǎn)物的羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

2.2.4 還原力的測(cè)定 Fe3+還原試驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)抗氧化劑提供電子或氫將Fe3+還原為Fe2+的能力，具有抗氧化活性的小分子肽和氨基酸的存在會(huì)影響樣品的還原能力[25]。酶解產(chǎn)物的還原能力可用來(lái)測(cè)量其抗氧化能力，在波長(zhǎng)700 nm 處，吸光度值越大，酶解產(chǎn)物的還原力越強(qiáng)，其抗氧化能力越高。如圖5所示，所有酶解產(chǎn)物的還原力水平均隨濃度的增加而增加。在相同濃度下，HA 的還原力高于HP。HA15 的還原能力最強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時(shí)其吸光度值為0.75。酶的種類影響酶解產(chǎn)物的還原能力，在相同的DH 下，HA 和HP 酶解物還原能力差異顯著（P＜0.05）。在HA 體系，酶解物隨DH 的升高，還原力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。而在HP 體系，DH 對(duì)其還原力影響不大（P＞0.05）。

圖5 不同水解度魚骨酶解產(chǎn)物的還原能力Fig.5 Reducibility of fish bone hydrolysates with different DHs

2.3 分子質(zhì)量分布

測(cè)定了6 種酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。將其分為4 個(gè)部分：＞1 500 u、1 000～1 500 u、1 000～200 u 和＜200 u。由圖6 可知，隨著水解程度的加大，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量發(fā)生顯著變化，大分子肽的比例下降，小分子肽的比例上升（P＜0.05）。由圖7 可知，當(dāng)水解度達(dá)15%時(shí)，HA15 和HP15 的分子質(zhì)量在1 000 ～200 u 的比例分別達(dá)到96.92%和85.95%，酶解效果較好。這是由于隨著酶解時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)分子間的肽鍵不斷斷裂，形成越來(lái)越多的小分子肽，分子質(zhì)量減小。

圖6 魚骨酶解物的分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.6 Chromatogram of molecular weight mass distribution of fish bone hydrolysates

圖7 魚骨酶解物的分子質(zhì)量分布Fig.7 Distribution of molecular weight of fish bone hydrolysates

3 結(jié)論

以汽爆鳙魚骨為原料，以DH 為指標(biāo)，篩選出堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶兩種蛋白酶酶解汽爆魚骨粉，制備不同DH 的魚骨酶解液，研究其抗氧化活性及分子質(zhì)量分布。結(jié)果表明，不同DH 的魚骨酶解物的抗氧化活性隨酶解產(chǎn)物濃度的增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。HA 具有較好的還原能力，而HP 具有較好的DPPH 自由基、ABTS 自由基和羥自由基清除能力，當(dāng)DH 為10%時(shí)，HP10對(duì)這3 種自由基清除率的IC50值分別為2.85，0.99 mg/mL 和4.91 mg/mL，分子質(zhì)量主要分布在500 u以下，達(dá)75.08%。在還原力和羥自由基體系，隨著DH 的增加，HA 的抗氧化活性隨DH 的增大而逐漸增強(qiáng)，而HP 與DH 之間沒(méi)有顯著的一致性規(guī)律。在ABTS 體系，HA 和HP 的抗氧化活性隨DH的增大呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減小的趨勢(shì)。隨著DH 的增大，蛋白質(zhì)間的肽鍵不斷斷裂，大分子逐漸降解，HA 和HP 的小分子質(zhì)量肽不斷增多。魚骨質(zhì)構(gòu)堅(jiān)硬，利用率低，采用汽爆技術(shù)預(yù)處理魚骨，研究其酶解產(chǎn)物的抗氧化性，可為提高魚骨資源利用率提供理論依據(jù)。今后還需開(kāi)展汽爆處理對(duì)魚骨結(jié)構(gòu)影響及酶解產(chǎn)物應(yīng)用的研究。