程照翔，方 超，呂純業(yè)*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院普通外科，2中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211100

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）作為人體細(xì)胞中占比最高的磷酸酶，在惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，通常被作為一種抑癌因子進(jìn)行研究［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，作為PP2A 核心基礎(chǔ)的催化亞基α亞型PP2Acɑ，其編碼基因PPP2CA突變與胃癌發(fā)生相關(guān)［2］。

N6?甲基腺苷（N6?methyladenosine，m6A）修飾是細(xì)胞中最為重要且保守的RNA 修飾［3］。生物信息學(xué)研究表明，作為m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的橋接蛋白WTAP，其高表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后密切相關(guān)［4］。

PP2A可以通過抑制細(xì)胞?髓細(xì)胞癥病毒性癌基因（cellular?myelocytomatosis viral oncogene，c?Myc）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病?2 基因（B?cell leukemia/lym?phoma 2，BCL）等癌基因或者癌蛋白的表達(dá)［5-7］，從而發(fā)揮抑癌作用；WTAP 卻往往會(huì)上調(diào)癌基因或者癌蛋白的水平［8-11］。二者在惡性腫瘤中均扮演重要角色，但作用大相徑庭，而且在胃癌中均無相關(guān)基礎(chǔ)研究，并缺乏相互關(guān)系的探索。因此，本文著重于研究抑制PP2Acα是否會(huì)影響胃癌細(xì)胞的惡性表型，以及在此過程中WTAP的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞系BGC?823（人胃腺癌細(xì)胞，低分化，上海碧云天生物公司）；慢病毒（上海凱基生物公司）；結(jié)晶紫染液（上海碧云天生物公司）；PCR引物（南京金斯瑞生物公司）；劃痕小室（易必迪公司，德國）；侵襲小室（康寧公司，美國）；RNA 抽提試劑盒（離心柱式，上海碧云天生物公司）；RT?qPCR 試劑盒（南京諾唯贊生物公司）；抗PP2A?Cα/β抗體（Santa Cruz 公司，美國）；抗WTAP 抗體（Proteintech公司，美國）；抗β?actin抗體（Santa Cruz公司，美國）；二抗（Rockland公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞系BGC?823，在補(bǔ)充有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。各組細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

根據(jù)BGC?823 的感染復(fù)數(shù)值（multiplicity of in?fection，MOI），BGC?823細(xì)胞的MOI值為100，用慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，敲減PPP2CA基因，進(jìn)而抑制PP2Acα的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h 后收獲細(xì)胞。然后用嘌呤霉素篩選出陽性表達(dá)的細(xì)胞，嘌呤霉素篩選濃度為2 μg/mL。實(shí)驗(yàn)所用shRNA 序列如下：sh?PPP2CA?1，5′?GATCCGTGGAACTTGACGATA?CTCTAACTCGAGTTAGAGTATCGTCAAGTTCCATT?TTTT?3′；sh?PPP2CA?2，5′?GATCCGCAGATCTTCT?GTCTACATGGTTCAAGAGACCATGTA?GACAGAA?GATCTGCTTTTTTG?3′；sh?PPP2CA?3，5′?GATCCG?GCAAATCACCAGATACAAATTTCAAGAG?AATTT?GTATCTGGTGATTTGCCTTTTTTG?3′。

1.2.3 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR

使用RNA 抽提試劑盒（離心柱式）從培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞中分離總RNA，然后使用Hiscrip?RT 試劑盒，按照手冊(cè)將1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用分光光度計(jì)測(cè)量RNA 的濃度。用熒光定量PCR 試劑盒在ABI StepOnePlusTM實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)。引物序列如下：GAPDH，5′?GGAGC?GAGATCCCTCCAAAAT?3′（正向引物），5′?GGCT?GTTGTCATACTTCTCATGG?3′（反向引物）；WTAP，5′?CTTCCCAAGAAGGTTCGATTGA?3′（正向引物），5′?TCAGACTCTCTTAGGCCAGTTAC?3′（反向引物）；PPP2CA，5′?CAAAAGAATCCAACGTGCAAG?AG?3′（正向引物），5′?CGTTCACGGTAACGAACCTT?3′（反向引物）。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析

將蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液、1%磷酸酶抑制劑混合物加入胃癌細(xì)胞中，冰上裂解30 min，提取蛋白質(zhì)。使用蛋白定量試劑盒（BCA法）對(duì)各組蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。在進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)之前，將5×SDS?PAGE蛋白上樣緩沖液按比例加入蛋白裂解物，煮沸10 min后放入-20 ℃冰箱保存。取蛋白提取物（30～50 μg）用于預(yù)制膠電泳，電泳結(jié)束后用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉1 h。TBST 輕微漂洗封閉液后與稀釋后的一抗（β?actin、PP2Acα、WTAP 一抗的稀釋比例均為1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜，第2天與相應(yīng)稀釋后的二抗（二抗稀釋比例為1∶10 000）在室溫下孵育1 h，最后在暗室中滴加適量顯影液后進(jìn)行曝光條帶。

1.2.5 克隆形成

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞以每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種到6 孔板中，并培養(yǎng)2～3 周，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，然后將形成的細(xì)胞團(tuán)用4%多聚甲醛固定15 min，最后結(jié)晶紫染色20 min。拍攝細(xì)胞團(tuán)成像，并用Image J 1.8.0 軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞團(tuán)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)均一式3份進(jìn)行，并重復(fù)至少3遍。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

配置胃癌細(xì)胞懸液，將每組細(xì)胞懸液稀釋成5×105個(gè)/mL。將上述細(xì)胞懸液加入ibidi 雙孔小室中，每個(gè)小室加入70 μL 細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后用無菌鑷子取出小室，并加入2 mL完全培養(yǎng)基，在0、12和24 h 時(shí)間點(diǎn)，觀察細(xì)胞并使用配有照相機(jī)的倒置顯微鏡捕獲圖像。

1.2.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

使用24孔鋪膠侵襲小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲測(cè)定，收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，并以1×105個(gè)/mL的密度懸浮在無FBS的DMEM培養(yǎng)基中。接下來，將200 μL的細(xì)胞懸液加到上室中，同時(shí)將500 μL 的含有10%FBS的DMEM添加到底部小室中。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，用棉簽除去上室中未遷移的細(xì)胞，并將過濾器底部侵襲的細(xì)胞在4%的低聚甲醛中于室溫固定5 min。PBS 洗滌后，用結(jié)晶紫染色，并在相差顯微鏡下在5個(gè)隨機(jī)選擇的視野中以×10的放大倍數(shù)（物鏡）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)（IACUC?2103060）。為了建立胃癌細(xì)胞的異種移植模型，從南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買裸鼠（雌性，4 周齡）。在注射之前，在以下標(biāo)準(zhǔn)條件下，將小鼠在無特定病原體的環(huán)境中飼養(yǎng)1 周：光照/黑暗周期12 h，溫度25 ℃，濕度40%～60%，滅菌食物和高壓蒸餾水。用100 μL 的PBS 重懸各組胃癌細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)量均為5×106個(gè)），分別皮下注射到每只小鼠的腋下（每組n=4）。4周后，對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，并對(duì)腫瘤稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有定量數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）。使用t檢驗(yàn)分析正態(tài)分布數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析使用的軟件包括Image J 1.8.0，GraphPad Prism 8。

2 結(jié)果

2.1 PPP2CA、WTAP 在胃癌組織中表達(dá)異常，二者均與胃癌預(yù)后相關(guān)

通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome At?las，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//www.cancer.gov）比較胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中的PP2Acα編碼基因PPP2CA 和WTAP 的mRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PPP2CA在胃癌組織中明顯下降（P=0.037；圖1A），而WTAP在胃癌組織中顯著上升（P<10-12，圖1B）。通過KM?plot網(wǎng)站（http：//kmplot.com/analysis/）進(jìn)行生存率分析，結(jié)果顯示PPP2CA高表達(dá)組、WTAP低表達(dá)組的預(yù)后顯著優(yōu)于各自的對(duì)照組（圖1C、D）。以上結(jié)果表明PPP2CA在胃癌組織中表達(dá)明顯下降，而WTAP在胃癌組織中卻顯著升高，且二者均與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)。

圖1 PPP2CA、WTAP在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌預(yù)后的關(guān)系Figure 1 The expression of PPP2CA and WTAP in gastric cancer and their relationship with the prognosis of gastric cancer

2.2 抑制PP2Acα可導(dǎo)致WTAP 的mRNA 及蛋白水平升高

為了探究PP2Acα與WTAP之間的關(guān)系，通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA 敲減胃癌細(xì)胞BGC?823 中的PPP2CA，抑制PP2Acα的表達(dá)。慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)熒光表達(dá)較強(qiáng)的Control 組、shRNA1 組、shRNA3組（圖2A）進(jìn)行嘌呤毒素篩選，獲得了穩(wěn)定低表達(dá)PP2Acα的胃癌細(xì)胞。并在mRNA 及蛋白水平驗(yàn)證敲減成功（圖2B、C）。對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞進(jìn)行RT?qPCR、Western blot 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制PP2Acα后，胃癌細(xì)胞BGC?823中的WTAP的mRNA及蛋白水平均明顯升高（圖2B、C）。

圖2 在骨癌細(xì)胞BGC?823中抑制PP2Acα對(duì)WTAP表達(dá)的影響Figure 2 Inhibition of PP2ACα could influence WTAP levels in gastric cancer cell BGC?823

2.3 體外實(shí)驗(yàn)表明抑制PP2Acα促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

為了探究抑制PP2Acα對(duì)胃癌細(xì)胞的影響，在離體條件下進(jìn)行了多種表型實(shí)驗(yàn)。抑制PP2Acα后，胃癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）特征，即細(xì)胞形態(tài)向梭形改變，同時(shí)細(xì)胞之間變得松散（圖3A）；克隆形成實(shí)驗(yàn)（圖3B）發(fā)現(xiàn)shRNA1、shRNA3組的增殖能力均較Control 組明顯上升（P<0.01）。以相同的細(xì)胞密度在ibidi小室內(nèi)鋪板，于貼壁后的0 h、12 h、24 h觀察劃痕愈合情況，發(fā)現(xiàn)shRNA1組、shRNA3 組的愈合能力在12 h 時(shí)已顯著快于Control組（圖3C）；且Tanswell 侵襲實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組的侵襲能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組（P<0.01，圖3D）。上述表型實(shí)驗(yàn)證明了抑制PP2Acα可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。

2.4 在體實(shí)驗(yàn)表明抑制PP2Acα促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞接種到4周齡雌性裸鼠的腋下（n=4）。4 周后，處死所有裸鼠，并分離出腫瘤。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積較對(duì)照組明顯增加（P<0.01，圖4）。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明在活體層面，抑制PP2Acα可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。

圖4 在體實(shí)驗(yàn)抑制PP2Acα對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 4 Inhibition of PP2Acα on the proliferation of gas?tric cancer cells in vivo

2.5 探究PP2Acα與WTAP二者之間的聯(lián)系

通過蛋白互作功能富集分析網(wǎng)站STRING（https：//string?db.org/），查詢PP2Acα與WTAP 二者之間的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)PP2Acɑ通過整合因子復(fù)合體亞基5（integrator complex subunit 5，INTS5）、RNA 聚合酶Ⅱ亞基2（RNA polymerase Ⅱsubunit B，POLR2B）與WTAP 建立聯(lián)系（圖5A）。但是數(shù)據(jù)庫顯示的證據(jù)不足以明確PP2Acɑ通過INTS5、POLR2B 調(diào)控WTAP 的表達(dá)或功能。為了明確PP2Acɑ與WTAP之間的調(diào)控關(guān)系，又通過磷酸化位點(diǎn)網(wǎng)站Phospho?site（http：//www.phosphosite.org）查詢WTAP 的磷酸化修飾情況，發(fā)現(xiàn)WTAP 的氨基酸序列存在大量磷酸化位點(diǎn)（圖5B）。這也意味著WTAP 上的磷酸化修飾可能會(huì)受到PP2Acα的調(diào)控，進(jìn)而影響WTAP的功能與表達(dá)。

圖5 探究PP2Acα與WTAP二者之間的聯(lián)系Figure 5 Explore the relationship between PP2ACα and WTAP

3 討論

PP2A 全酶是由結(jié)構(gòu)亞基A（65 kDa），調(diào)節(jié)亞基B（50～130 kDa）和催化亞基C（36 kDa）組成的異源三聚體。催化亞基C為PP2A全酶的核心結(jié)構(gòu)，具有2個(gè)亞型：PP2Acα（由PPP2CA基因編碼）和PP2Acβ（由PPP2CB 基因編碼），PP2Acα 的比例遠(yuǎn)高于PP2Acβ（約9 倍）［12］。因此，PP2Acα的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致PP2A全酶活性降低，影響體內(nèi)磷酸化穩(wěn)態(tài)的維持，進(jìn)而誘導(dǎo)或促進(jìn)各種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［13］。

臨床研究發(fā)現(xiàn)PP2Acɑ的低表達(dá)與直腸癌的T、N、M分期相關(guān)，且PP2Acɑ低表達(dá)患者的預(yù)后更差［14］；PP2Acɑ表達(dá)的恢復(fù)可逆轉(zhuǎn)EMT，并抑制前列腺腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［15］；在肝癌細(xì)胞中，PP2Acɑ可以抑制P53 引起的癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖［16］。但PP2Acɑ 在胃癌中的作用卻鮮有報(bào)道，通過Pubmed 數(shù)據(jù)庫檢索，PP2Acɑ與胃癌的相關(guān)研究僅有1篇文章，2017年Huang等［2］發(fā)現(xiàn)PPP2CA的遺傳變異與中國人群胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。但胃癌惡性表型的針對(duì)性研究，并未有PP2Acɑ的相關(guān)報(bào)道，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

WTAP作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中的橋接蛋白，具有穩(wěn)定METTL3、METTL14的作用［17］。這一基礎(chǔ)使得WTAP 可參與細(xì)胞的許多生命過程，例如選擇性剪接，X 染色體失活和細(xì)胞周期調(diào)控［18］。正因?yàn)檫@樣，WTAP 的表達(dá)失調(diào)可以促進(jìn)多種惡性腫瘤的發(fā)展。例如，過表達(dá)WTAP 可通過穩(wěn)定周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而促進(jìn)腎細(xì)胞癌的進(jìn)展［19］；其也可通過Wnt/β?catein 信號(hào)通路來增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌的抗藥性［20］；還可通過刺激轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metallopeptidase 7，MMP7）和基質(zhì)金屬蛋白酶28（matrix metallopeptidase 7，MMP28）的表達(dá)來增強(qiáng)膽管癌的侵襲性［21］。所以，WTAP 的表達(dá)水平與胃癌進(jìn)展的關(guān)系也是值得深入研究的，但目前僅有生物信息學(xué)文章支持WTAP的高表達(dá)與胃癌進(jìn)展相關(guān)，相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)仍然缺乏。

因此，本研究初步探究了PP2Acɑ失調(diào)與胃癌進(jìn)展的聯(lián)系，以及在這一過程中WTAP 表達(dá)水平的變化。本研究中，通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA抑制胃癌細(xì)胞中PP2Acɑ的表達(dá)，隨后進(jìn)行的細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)表明，胃癌細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)EMT典型特征，并且增殖、遷移與侵襲能力均得到增強(qiáng)；裸鼠層面的活體實(shí)驗(yàn)，也證明了抑制PP2Acɑ可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖；RT?qPCR、WB實(shí)驗(yàn)表明，WTAP的mRNA與蛋白水平均顯著升高?；谏鲜鲇懻摷皩?shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)，抑制PP2Acɑ促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性表型，可能是通過上調(diào)WTAP的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。

為了探究PP2Acɑ與WTAP之間的調(diào)控關(guān)系，筆者首先通過蛋白互作功能富集分析網(wǎng)站STRING，查詢這兩種蛋白之間的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)PP2Acɑ通過INTS5、POLR2B與WTAP建立聯(lián)系。但是數(shù)據(jù)庫顯示的證據(jù)不足以明確PP2Acɑ通過INTS5、POLR2B調(diào)控WTAP 的表達(dá)或功能。為了明確PP2Acɑ與WTAP 之間的調(diào)控關(guān)系，筆者又通過Phosphosite 網(wǎng)站查詢WTAP 的磷酸化修飾情況，發(fā)現(xiàn)WTAP 的氨基酸序列存在大量磷酸化位點(diǎn)。這表明WTAP的功能會(huì)受到磷酸化修飾的影響，而磷酸化修飾往往伴隨蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的改變，最終導(dǎo)致蛋白總量的變化。PP2Acɑ對(duì)于體內(nèi)磷酸化穩(wěn)態(tài)的維持必不可少，其表達(dá)失調(diào)會(huì)對(duì)蛋白的表達(dá)和功能產(chǎn)生重要影響，這或許可以解釋本研究中出現(xiàn)的結(jié)果，即在胃癌細(xì)胞中抑制PP2Acɑ可導(dǎo)致WTAP的表達(dá)上升，但這一機(jī)制需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)深入探究加以完善。

綜上，通過本研究，發(fā)現(xiàn)抑制PP2Acɑ可以促進(jìn)胃癌的增殖、遷移與侵襲，并且在這一過程中WTAP的表達(dá)顯著上調(diào)。這些結(jié)果將有助于進(jìn)一步對(duì)胃癌的深入研究，并對(duì)胃癌診療具有重要意義。