薛姝婧 高媛媛 楊俏玲 李光華 耿瑤

摘?要：目的：探討PI3K/Akt信號(hào)通路在過(guò)氧化氫（H2O2）致大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。方法：體外培養(yǎng)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞（RAEC），復(fù)制H2O2氧化損傷模型，采用PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性阻斷劑渥曼青霉素（Wortmannin，W）對(duì)模型細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組、H2O2組、H2O2+渥曼青霉素（W）組，采用Western?blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl2及Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果：渥曼青霉素干預(yù)后，與對(duì)照組比較，H2O2組及H2O2+W組Bcl2蛋白表達(dá)和Bcl2/Bax比值下降、Bax蛋白表達(dá)升高（P均<0.05）。H2O2組與H2O2+W組間Bcl2蛋白表達(dá)和Bcl2/Bax比值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。H2O2+W組Bax蛋白表達(dá)高于H2O2組（P<0.05）。結(jié)論：渥曼青霉素抑制PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)過(guò)氧化氫致血管內(nèi)細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激;血管內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;PI3K/AKT

血管內(nèi)皮細(xì)胞位是血管組織內(nèi)壁的單層柱狀上皮細(xì)胞，它是機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)對(duì)抗外部損失與破壞的第一道防線，它不僅具有內(nèi)分泌功能，還具有對(duì)血管組織的保護(hù)功能能，對(duì)維持機(jī)體正常血液循環(huán)的穩(wěn)定狀態(tài)具有重要作用[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性一旦破壞，會(huì)導(dǎo)致高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及血栓等一系列疾病[2]。渥曼青霉素及其類似物是真菌的代謝產(chǎn)物，可以通過(guò)與胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（PI3K）的催化亞單位p110結(jié)合，不可逆地抑制PI3K的激酶活性，從而阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路[3]。渥曼青霉素極其類似物是真菌的代謝產(chǎn)物，可以通過(guò)與PI3K的催化亞單位p110結(jié)合，非競(jìng)爭(zhēng)性和不可逆的阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路[3]，抑制信號(hào)通路的傳導(dǎo)，因此本研究主要以H2O2復(fù)制內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，采用PI3K信號(hào)通路抑制劑渥曼青霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路下游Bcl2、Bax的表達(dá)情況，探討PI3K/AKT信號(hào)通路在H2O2致體外培養(yǎng)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞（RAEC）氧化損傷中的作用，明確PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)過(guò)氧化氫致細(xì)胞凋亡的作用。

一、材料和方法

（一）主要試劑和儀器

大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（RAEC，為原代細(xì)胞）;H2O2（30%）;渥曼青霉素;Bcl2、Bax一抗;大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基。CO2培養(yǎng)箱;Transblot?SD半干轉(zhuǎn)印槽;電泳凝膠成像分析儀（TH690B）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

RAEC（大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞）在37℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)時(shí)開始傳代，并分三組：對(duì)照組、H2O2組、H2O2+渥曼青霉素（W）組。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（每50mL加0.5mL的青鏈霉素混合液及300μL的環(huán)丙沙星注射液）顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)，放入37℃、5%CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中靜置24h過(guò)夜，第二天更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)是否穩(wěn)定、內(nèi)皮細(xì)胞貼壁數(shù)量是否超80%時(shí)進(jìn)行傳代。

3.過(guò)氧化氫損傷主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞模型制備

30%過(guò)氧化氫原液用滅菌三蒸水稀釋得1mmol·L-1的過(guò)氧化氫母液;使用前吸取大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液稀釋過(guò)氧化氫母液，得終濃度為100μmol·L-1的過(guò)氧化氫培養(yǎng)基。用微量移液器將大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮單細(xì)胞混懸液接種在96孔板上，每孔接種100μL，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁并待生長(zhǎng)至覆蓋85%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用多通道移液器加入上述終濃度含100μmol·L-1過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，制成過(guò)氧化氫損傷細(xì)胞模型。

4.CCK8法檢測(cè)渥曼青霉素對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響及渥曼青霉素最大抑菌濃度篩選

將大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分為6組，每組5個(gè)復(fù)孔，1×104個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入含有0、10、50、100、500和1000nmol·L-1渥曼青霉素的不同濃度的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h和48h。按照試劑使用說(shuō)明書，用完全培養(yǎng)基1︰10稀釋CCK8原液，每孔加入100μL稀釋液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h。待板內(nèi)液體變成橙黃色時(shí)，放入酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)450nm）中檢測(cè)，記錄光密度（OD）值，計(jì)算出各組細(xì)胞的存活率（細(xì)胞存活率=[（AsAb）/（AcAb）]×100%;抑制率=[（AcAs）/（AcAb）]×100%;As：實(shí)驗(yàn)孔吸光度;Ac：對(duì)照孔吸光度;Ab：空白孔吸光度），篩選對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞抑制率最大的渥曼青霉素濃度。

5.Western?blot檢測(cè)

將三組組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞消化收集完畢，檢測(cè)其Bcl2，Bax蛋白表達(dá)含量，使用PBS沖洗洗3遍。置于低溫環(huán)境下，使用搖床進(jìn)行震蕩混勻30min，加入Lysis?Buffer，15000r·min1，低溫離心20min，取上清為全蛋白提取物，蛋白定量（BCA法）后，分別保存于超低溫冰箱（-80℃）。隨后，取凍存蛋白100μg上樣，緩沖液按照8∶2體積混合并加入到樣本中，沸水煮沸10min。一式四份，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（15%）分離轉(zhuǎn)膜（PVDF），用脫脂奶粉（5%）低溫（4℃）封閉1h。分別加入抗bcl2（2∶400）、抗bax（1∶3000）、抗βactin（1∶500）一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次，每次10min。二抗（1∶800），低溫孵育2h。采用PBST洗膜、ECL化學(xué)發(fā)光、顯影。運(yùn)用Quantity?One圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值表示各組結(jié)果。