張曉寧 楊紅 張燁 陳博雯 肖玉菲 覃子海 劉海龍

摘 要：為探討澳洲茶樹組培苗耐受低溫的能力及對低溫脅迫的響應機制，該文測定了3月齡澳洲茶樹組培苗低溫處理過程及恢復培養(yǎng)后葉片葉綠素（Chl）、丙二醛（MDA）、抗氧化物酶（SOD，POD，CAT）、抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、游離脯氨酸（Pro）的變化。結果表明：（1）-5 ℃脅迫24 h，保護酶及抗氧化物含量均顯著下降，MDA含量顯著上升。（2）0 ℃下，AsA和GSH先降后升，POD和CAT相反，SOD持續(xù)升高;脅迫48 h后保護酶活性顯著升高，抗氧化劑含量顯著降低。（3）10 ℃下，SOD活性先降后升;脅迫48 h后，滲透調(diào)節(jié)物質含量均顯著升高。因此，3月齡澳洲茶樹組培苗在-5 ℃受到致死凍害，幼苗能通過啟動抗氧化系統(tǒng)及快速積累滲透調(diào)節(jié)物質響應0 ℃以上低溫脅迫，但對10 ℃和0 ℃兩種低溫脅迫的應答機制卻存在一定的差異。該研究結果將有助于深入了解其對低溫的耐受能力及生理響應機制，為合理引種及規(guī)模化種植提供理論依據(jù)。

關鍵詞：澳洲茶樹，低溫脅迫，形態(tài)特征，抗氧化物酶，抗氧化劑，滲透調(diào)節(jié)物質

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）09-1534-08

Abstract：To explore the response and adaptive mechanisms of Melaleuca alternifolia tissue culture seedlings to cold stress，3-month-old tissue culture seedlings were exposed to low temperatures and then recovered at air temperature，the physiological indexes including chlorophyll （Chl），malondialdehyde （MDA），antioxidant enzymes （SOD，POD，CAT），ascorbic acid （AsA），glutathione （GSH），soluble sugar （SS），soluble protein （SP），free proline （Pro）were examined. The results were as follows：（1）The stress at -5 ℃ for 24 h caused a significant decrease in the activities of antioxidant enzymes and the contents of antioxidants，but an increase in the content of MDA. （2）At 0 ℃，the activities of POD and CAT first rose and then descended，while the contents of AsA and GSH showed an opposite pattern; After 48 h of stress，the activities of protective enzymes significantly increased but the contents of antioxidants decreased. （3）At 10 ℃，the activity of SOD first elevated and then declined; All three osmotic regulators manifested a remarkable elevation after the 48 h of stress. Collectively，the 3-month-old tissue cultures seedlings of M. alternifolia could be lethally injured at -5 ℃，but they were able to survive the low temperature above 0 ℃ by rapidly increasing protective enzyme activities and accumulating osmotic regulators. However，there was a certain difference in mechanisms underlying the response to low temperature stress at 10 ℃ and 0 ℃. The results of this study will help to understand its cold resistance ability and physiological response mechanism，and provide the theoretical basis for rational introduction and large scales of planting.

Key words： Melaleuca alternifolia，low temperature stress，morphology characteristics，antioxidant enzymes，antioxidants，osmotic regulators

澳洲茶樹（Melaleuca alternifolia）又稱互葉白千層，為桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（Melaleuca）常綠小喬木，原產(chǎn)澳大利亞（Shabir，2005），其新鮮枝葉提取的精油即澳洲茶樹油（tea tree oil），又稱TTO，享譽世界。TTO具抗氧化、抗菌消炎、抗癌等生理活性，能高效、無毒、無刺激地殺死人體皮膚表面的真菌和細菌，并對某些病毒有抑制作用，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的天然抗菌劑之一，被廣泛應用于制藥、日化、食品和生物材料等行業(yè)（Sanyang et al.，2017; Byahatti et al.，2018; Felipe et al.，2018; De Assis et al.，2020; Lee et al.，2020）。

鑒于其重要的經(jīng)濟價值和巨大的應用潛力，世界各國紛紛引種栽培，我國自20世紀90年代開始引種種植，目前在廣東、廣西、福建、海南等9個南方?。▍^(qū)）推廣種植。大量研究表明，低溫脅迫不但影響植物的產(chǎn)量和品質，也影響著植物的引種和分布（何介南等，2019）。低溫脅迫會導致細胞膜脂相變，影響細胞膜系統(tǒng)的選擇透性和流動性（Yildiz et al.，2014）。受損的細胞膜可進一步造成細胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，誘發(fā)氧化脅迫，引起蛋白質和核酸的氧化，形成脂質過氧化的最終產(chǎn)物MDA。低溫脅迫還會抑制葉綠素的合成（曹陽和張旭艷，2019;劉育梅等，2019），影響光合作用和呼吸作用，最終導致植株生長減緩甚至最終死亡。植株在長期進化過程中形成了一系列防御機制，如啟動抗氧化系統(tǒng)清除過量的ROS，也可通過提高滲透調(diào)節(jié)物質濃度增加細胞液濃度，提高細胞保水能力，降低細胞冰點，提高其應對低溫脅迫能力（Meng et al.，2015; 曹紅星等，2017）。

4-松油醇型互葉白千層喜陽喜熱，怕霜怕低溫，適合在年平均氣溫19～23 ℃，連續(xù)霜期不超過一周的地方種植（官自朝，2000;何介南等，2019）。吳麗君等（2017）在福建永安和邵武2個試驗地種植了澳洲茶樹組培苗和扦插苗，在2014年2月份（1—2月為年氣溫最低月份，其中1月和2月最低氣溫分別為-4 ℃和-5.5 ℃）均觀察到扦插苗發(fā)生嚴重凍害，而組培苗凍害癥狀表現(xiàn)較輕，并認為組培苗抗凍能力強于扦插苗。莫邵展等（2008）對2008年我國南方遭受的百年不遇的冰凍災害前后3年生互葉白千層葉片電導率、丙二醛、過氧化物酶、硝酸還原酶等4個生理指標進行了研究，認為互葉白千層具有較強的抵抗低溫的能力。然而這些研究只停留在少數(shù)幾個生理指標的測定或單純形態(tài)特征的觀察。由于澳洲茶樹在我國引種栽培歷時短，其抗寒耐性尤其是組培苗的抗寒能力還未見系統(tǒng)研究報道。為深入了解澳洲茶樹組培幼苗的抗寒性能及適栽區(qū)域，項目組在前人研究的基礎上，以移植3個月的澳洲茶樹組培苗（出圃移栽的最佳苗齡）為研究對象，通過對10、0、-5 ℃短期低溫脅迫及恢復培養(yǎng)過程中植株葉片形態(tài)特征及10個抗寒生理指標變化規(guī)律的觀測，分析闡述了澳洲茶樹耐受低溫能力及對低溫的響應與適應機制，為開展防寒栽培，合理引種及規(guī)?；N植等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2018年6—9月進行，將生根良好的4-松油醇型澳洲茶樹組培苗栽植于廣西林科院露天苗圃的紅泥基質杯里，在此期間苗圃最低溫度24 ℃，最高溫度36 ℃。生長3個月后選取苗高約30 cm、地徑約0.2 cm、長勢基本一致的上述植株作為供試材料進行生理指標測定。

1.2 試驗設計

設10、0、-5 ℃ 3個溫度處理。低溫脅迫處理在光照培養(yǎng)箱進行，16 h光照培養(yǎng)，8 h暗培養(yǎng)，光照強度4 800 lx。每天上午8：00手托幼苗噴水至基質，直至基質滴水為止。低溫脅迫后將植株轉移到露天苗圃中（溫度在24～33 ℃之間）進行恢復培養(yǎng)，水分條件與試驗組保持一致。每個溫度處理隨機選取18株幼苗（3個重復，每重復6株幼苗），分別于脅迫0 h（對照）、12、24、48 h以及恢復培養(yǎng) 72 h后摘取6株幼苗相同部位（中上部）葉片0.2 g投入液氮，經(jīng)速凍后轉移至-80 ℃超低溫冰箱保存，進行后續(xù)相關生理指標的測定。

1.3 測定項目和方法

澳洲茶樹葉片丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定;超氧化物歧化酶（SOD）活性采用黃嘌呤氧化酶法測定;過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定;過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫分解法測定;可溶性蛋白（SP）采用考馬斯亮藍法測定;可溶性糖（SS）含量用蒽酮比色法測定;葉綠素（Chl）含量、游離脯氨酸（Pro）含量參照李玲等（2009）的方法測定;抗壞血酸（AsA）含量參照Ma & Cheng（2003）的方法測定;谷胱甘肽（GSH）含量參照施海濤（2016）的方法測定。以上指標采用上海嵐派提供的96 T試劑盒。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件SPSS 20.0和Microsoft Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，測定結果為3次平均值±標準誤，數(shù)據(jù)差異的顯著性采用SPSS單因素方差分析中的 Duncan 新復極差法進行估算。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對澳洲茶樹幼苗植株形態(tài)的影響

從圖1可以看出，10 ℃和0 ℃低溫脅迫48 h及恢復培養(yǎng)72 h后，植株葉型葉色與對照基本一致; -5 ℃脅迫24 h，植株葉片卷曲下垂，葉色變?yōu)榛揖G色，且恢復培養(yǎng)72 h后不能恢復正常形態(tài)，故該溫度下只在0、12、24 h 3個時間點取樣進行各生理指標的測定。

2.2 低溫脅迫下澳洲茶樹幼苗抗寒生理指標的變化

2.2.1低溫脅迫下葉綠素含量的變化 由圖2可知，葉綠素含量在-5 ℃脅迫下變化不顯著;在10 ℃和0 ℃下呈降-升-降的動態(tài)波動。葉綠素的合成是一個極其復雜的過程，包含一系列的酶促反應。脅迫初期葉綠素含量的降低可能是低溫抑制了合成過程中催化酶的活性，進而影響了葉綠素的合成?？傮w而言，在整個脅迫過程中葉綠素含量變化規(guī)律不明顯。

2.2.2低溫脅迫下MDA含量的變化 由圖3可知，-5 ℃脅迫下MDA含量持續(xù)升高，在0 ℃和10 ℃下，MDA含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。其中0 ℃下脅迫24 h開始下降，10 ℃下恢復培養(yǎng)后才開始下降。3種溫度下，MDA 含量均較脅迫前顯著升高，說明MDA含量對低溫脅迫較敏感。

2.2.3 低溫脅迫下保護酶活性的變化 由圖4、圖5、圖6可知，-5 ℃脅迫24 h后，3種酶活性均顯著降低;0 ℃脅迫下，SOD活性持續(xù)增加，POD和CAT先升后降，表明0 ℃脅迫初期，3種酶活性迅速升高以響應低溫脅迫，SOD參與整個脅迫過程中自由基的清除;10 ℃脅迫下POD和CAT活性先升后降，SOD先降后升，脅迫前12 h SOD活性下降可能是因為10 ℃低溫脅迫抑制了SOD活性，或SOD對較為緩和的10 ℃低溫不敏感。總之，3種酶在10 ℃和0 ℃脅迫48 h 后含量均顯著上升（除10 ℃脅迫48 h SOD酶活性含量下降外），表明3種抗氧化物酶參與植株應對低溫脅迫。

2.2.4 低溫脅迫下非酶抗氧化物質含量的變化 由圖7、圖8可知，-5 ℃脅迫24 h，AsA和 GSH含量均顯著下降;AsA在10 ℃和0 ℃下含量先降后升，GSH 在10 ℃下也呈先降后升的趨勢，在0 ℃下呈降升降的動態(tài)波動。推測AsA及GSH含量先降后升可能是前期作為底物參與抗氧化系統(tǒng)，后期再循環(huán)重新生成。

2.2.5低溫脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質含量的變化 由圖9、圖10、圖11可知，-5 ℃脅迫24 h Pro含量顯著下降，SS含量顯著上升，SP含量略有升高，但變化不顯著;0 ℃脅迫前后SP含量顯著增加，SS和Pro含量沒有顯著變化;10 ℃脅迫前后，3種物質含量均顯著增加，表明植株可能通過滲透調(diào)節(jié)物質的積累應對較緩和的低溫脅迫。

3 討論與結論

低溫是限制植物生長、發(fā)育和分布的重要環(huán)境因子。樹木在幼苗階段在生理和形態(tài)等方面對低溫脅迫較敏感，會導致細胞損傷、生長減緩，甚至植株死亡（Yildiz et al.，2014）。細胞膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害的原發(fā)部位，低溫脅迫積累的過量ROS會誘發(fā)膜脂過氧化，MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，它通過與膜結構上的酶和蛋白質相結合、交聯(lián)并使之失去活性來破壞細胞膜結構。因此，MDA含量能直接反映膜受損程度（Rakei et al.，2016）。3種溫度脅迫下，澳洲茶樹幼苗葉片MDA含量均較脅迫前顯著增加，推測低溫脅迫對細胞膜系統(tǒng)產(chǎn)生的損害在10 ℃就已經(jīng)發(fā)生。紅松和西伯利亞松MDA含量的變化也表明，幼苗早在0 ℃就開始經(jīng)歷低溫造成的損傷（Wang et al.，2019）。MDA含量的變化受脅迫程度、脅迫時間等因素影響，如0 ℃低溫下MDA含量先升后降，達到最大值的時間為24 h，表明此時植株受到的損傷達到最大（Wang et al.，2019），之后通過啟動應激防御系統(tǒng)如抗氧化系統(tǒng)完成對膜系統(tǒng)損傷的有效修復。在10 ℃，MDA含量持續(xù)緩慢上升，直到恢復培養(yǎng)后含量才逐漸下降。推測這與10 ℃下膜系統(tǒng)受到的損傷比較緩和有關，這種MDA在短期較為緩和的低溫脅迫下持續(xù)緩慢增加的現(xiàn)象體現(xiàn)了植株對輕度低溫逆境的適應能力及對輕度低溫損傷的承受能力。

低溫逆境在提高細胞ROS水平的同時，也會誘發(fā)植物防御體系的建立，SOD、POD、CAT、AsA、GSH等參與逆境脅迫中ROS的清除，其活性或含量的升高被認為是植物體對逆境脅迫的一種應激反應，可增強植物的抗逆性（Díaz et al.，2019）。研究表明冷凍誘導ROS抗氧化酶表達升高以清除過量的ROS，是紅豆杉抗凍機制之一（Meng et al.，2017）。SOD是植物防御體系中的第一道防線，能催化超氧陰離子（O2-·）生成毒性較小的H2O2，H2O2可進一步被POD和CAT分解成水和氧氣（Farhangi Abriz & Torabian，2017）。研究表明SOD活性變化與植物抗寒性能有關，一般認為SOD的活性可以被低溫所激活，使其提高對低溫的適應能力，當?shù)蜏貢r間延長時，活性隨著脅迫時間的推移而下降（鄒志榮和陸幗一，1994）。但不同物種，甚至是同一物種不同抗寒能力的品種在應對低溫脅迫時，SOD變化規(guī)律都不盡相同，如10、6、0 ℃脅迫12 h后大花五椏果SOD活性較22 ℃對照顯著升高，非洲桃花心木保持不變，雙翼豆則顯著下降（何躍君等，2008）;抗寒性強的“東農(nóng)冬麥1號”，SOD先升后降，抗寒性弱的“濟麥22”，SOD活性在脅迫前期基本維持平穩(wěn)，后隨時間延長呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢（孫蕊等，2015）。SOD活性的變化還與脅迫程度及時間有關。本研究中0 ℃下SOD活性持續(xù)升高，10 ℃ SOD活性先降后升，這與海南山竹子SOD的變化規(guī)律相似，海南山竹子3 ℃脅迫12 h后SOD活性較25 ℃顯著升高，而10 ℃則顯著下降（何躍君等，2008）。推測10 ℃脅迫前期SOD活性的下降可能是低溫抑制的結果，隨著脅迫時間的延長，SOD抗氧化系統(tǒng)逐漸被激活。植物的抗寒響應是一個復雜的過程，受多種酶和非酶系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)。本研究中10 ℃脅迫過程中，雖然SOD活性顯著低于脅迫前，但其他2種保護酶脅迫后活性顯著升高;同時，在0 ℃下3種保護酶活性均顯著增加。這表明多種抗氧化酶協(xié)同作用，共同參與澳洲茶樹對低溫脅迫的響應和適應過程。

AsA、GSH作為抗氧化劑也可通過多種途徑直接或間接的猝滅活性氧（Farhangi Abriz & Torabian，2017）。研究表明低溫脅迫顯著增加了地中海松樹幼苗GSH的含量，且在耐冷性品種積累量為冷敏感的5倍多（Tabi et al.，2018）。本研究中10 ℃和0 ℃下AsA、GSH先降后升，推測這兩種抗氧化物質脅迫初期作為底物參與抗氧化系統(tǒng)，后通過AsA-GSH 再循環(huán)生成。

SS是植物生長最基本的能量來源，同時也作為冷凍保護劑、滲透調(diào)節(jié)物質、活性氧清除劑，以及信號分子調(diào)節(jié)與抗冷相關基因的表達，以保護植物免受低溫傷害（Ma et al.，2009; Ruelland et al.，2009; Van den Ende & Valluru，2009; Wei et al.，2017），因此其含量與耐寒性密切相關（Rubio et al.，2016; Zhao et al.，2020）。低溫脅迫時，蔗糖可分解為葡萄糖和果糖，使SS的濃度加倍，從而維持低溫脅迫時的滲透平衡（Ruan & Yong，2014）。本研究中，SS含量在-5 ℃持續(xù)上升，推測可能是在-5 ℃葉片細胞結構受到嚴重破壞，蔗糖分解或前期積累的SS來不及代謝的結果;在0 ℃和10 ℃下先升后降，前期含量升高快速響應低溫脅迫，后期降低的原因可能是植物內(nèi)部代謝消耗所致。SP作為一種低溫誘導蛋白，其含量隨低溫鍛煉的進行而升高（Zhang et al.，2019）。增加的SP可能包含在低溫脅迫中參與生化調(diào)節(jié)的酶和蛋白，以及與信號、調(diào)控、保護、修復逆境損傷相關的蛋白（Strimbeck et al.，2015）。澳洲茶樹無性系幼苗在0 ℃和10 ℃可忍受的低溫范圍內(nèi)，隨脅迫的持續(xù)其SP含量持續(xù)增加，在-5 ℃較惡劣的條件下SP先升后降。這與松樹的研究結果剛好相反，在0 ℃和-20 ℃可忍受的溫度范圍內(nèi)SP含量隨脅迫時間的延長先升后降，而在-60 ℃和-80 ℃則保持穩(wěn)定（Wang et al.，2019），推測SP的不同變化規(guī)律與這兩個樹種的低溫耐性有關，松樹是耐寒樹種，澳洲茶樹對低溫相對較為敏感。Pro含量的升高也常被用作衡量植物對低溫逆境的適應能力（蘇建華，2017）。然而本研究中，僅在10 ℃脅迫48 h下Pro含量持續(xù)顯著增加，0 ℃脅迫下Pro含量呈升降升的動態(tài)平衡，-5 ℃時則直線下降。-5 ℃下Pro含量的直線下降可能是由細胞膜透性和完整性受到損傷引起的細胞液滲漏導致的?？傊?，Pro、SS、SP 3種滲透調(diào)節(jié)物質在0 ℃和10 ℃ 2種低溫脅迫初期12 h迅速增加，且在10 ℃脅迫后顯著增加。這似乎預示著在這2種低溫脅迫下，澳洲茶樹均能通過快速積累滲透調(diào)節(jié)物質含量迅速進行響應。總體而言，植株在響應0 ℃和10 ℃低溫脅迫時表現(xiàn)出一定的差異性。

本研究通過對不同低溫脅迫的澳洲茶樹外觀形態(tài)及10個與抗寒密切相關的生理指標的觀測，結果表明澳洲茶樹組培苗能忍受0 ℃以上低溫脅迫，在-5 ℃下受到低溫凍害較嚴重，這與蘇建華（2017）的研究結果相似，即澳洲茶樹組培苗至少可以忍受短暫的0 ℃左右低溫。而吳麗君等（2014）的研究認為澳洲茶樹組培苗較扦插苗抗寒，在-5.5 ℃的低溫下，組培苗僅有輕微凍傷，且隨氣溫升高可陸續(xù)恢復葉色。與本結果不一致的可能原因是吳麗君的研究對象苗齡較大且種植在田間經(jīng)歷了自然降溫的抗寒鍛煉。因此，在生產(chǎn)中，建議種植區(qū)域極端低溫在0 ℃左右，若在0 ℃以下區(qū)域種植，盡量在9月份以前完成造林，以保證幼苗有足夠的生長時間以增加其抗寒性能。關于不同苗齡的組培幼苗、成年植株的抗寒性及對低溫的響應機制今后需進一步的研究驗證。總之，本文系統(tǒng)研究了澳洲茶樹組培苗耐受低溫能力及對低溫的響應與適應機制，為今后開展科學合理栽培，引種及規(guī)?；N植等提供了理論依據(jù)。

致 謝 中國科學院昆明植物研究所劉莉研究員對文章撰寫給予了指導，謹致謝意！

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（責任編輯 周翠鳴）