付春 黃春莉 江納 楊瑤君

摘 要：WOX基因家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物發(fā)育關(guān)鍵時期，如胚的形成、維持干細(xì)胞穩(wěn)定性和器官形成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。為探究WOX轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控中華獼猴桃的生長發(fā)育的分子理論基礎(chǔ)，該文利用ProtParam、Cell-PLoc2.0、SignalP4.1 Server等在線軟件對中華獼猴桃的16個WOX轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行理化特性、亞細(xì)胞定位和信號肽等詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：（1）中華獼猴WOX轉(zhuǎn)錄因子的所有蛋白成員的氨基酸數(shù)目在138～371之間，分子量為16.222～42.185 kD，均定位于細(xì)胞核的不穩(wěn)定親水蛋白。（2）中華獼猴桃的16個WOX蛋白成員均屬于Homodomain超家族，僅Achn362451是分泌蛋白，且僅Achn362451和Achn141001具有跨膜區(qū)。（3）大部分WOX蛋白成員的潛在磷酸化位點(diǎn)都位于絲氨酸處。（4）其二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，其次為α-螺旋。（5）保守基序分析結(jié)果表明中華獼猴桃的16個WOX蛋白成員均含有motif1。（6）系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明中華獼猴桃與菠蘿的親緣關(guān)系最近，與番茄的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。（7）在中華獼猴桃果實成熟過程中不同時期的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明其WOX基因家族中4個成員Achn131681、Achn145561、Achn336591、Achn362451基因在授粉后20、120、127 d表達(dá)含量都較高，其他12個WOX基因成員表達(dá)含量低甚至不表達(dá)。該研究為進(jìn)一步研究中華獼猴桃WOX轉(zhuǎn)錄因子在其生長發(fā)育過程中的分子機(jī)理提供了一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：中華獼猴桃，WOX，轉(zhuǎn)錄因子，基因家族，生物信息學(xué)分析

中圖分類號：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）09-1561-15

Abstract：WOX gene family is a kind of transcription factor peculiar to plants，and plays an important regulatory role in the critical stages of plant development，such as embryo formation，stem cell stability and organ formation. In order to explore the molecular basis of WOX transcription factors regulating the growth and development of Actinidia chinensis，the physical and chemical characteristics，subcellular localization and signal peptide of 16 WOX transcription factors in A. chinensis were analyzed by ProtParam，Cell-PLoc2.0，SignalP4.1 Server online software in detail in this study. The results were as follows：（1）The amino acid number of all protein members of WOX transcription factors in A. chinensis ranged from 138 to 371，with molecular weight ranging from 16.222 to 42.185 kD，all of which were unstable hydrophilic proteins located in nucleus. （2）The 16 WOX protein members of A. chinensis belonged to Homodomain superfamily，only Achn362451 was secreted protein，and only Achn362451 and Achn141001 had transmembrane regions. （3）The potential phosphorylation sites of most WOX members were located in serine site. （4）The secondary structure of WOX proteins was mainly random coil，followed by α-helix. （5）Conservative motifs analysis results showed that all 16 WOX protein members of A. chinensis contained motif1. （6）Phylogenetic analysis results showed that the genetic relationship between A. chinensis and Ananas comosus was the closest，and that between Actinidia chinensis and Solanum lycopersicum was the farthest. （7）The results of transcriptome analysis in different stages of fruit ripening process of Actinidia chinensis showed that four members of the WOX gene family，Achn131681，Achn145561，Achn336591，Achn362451，were highly expressed on 20，120，127 d after pollination，while those of the other 12 WOX gene members were low or even not expressed. This study provides a reference basis for further study on the molecular mechanism of WOX transcription factors in the growth and development of A. chinensis.

Key words：Actinidia chinensis，WOX，transcription factor，gene family，bioinformatics analysis

中華獼猴桃（Actinidia chinensis），多年生藤本植物，是杜鵑花目（Ericales）獼猴桃科（Actinidiaceae）的一種經(jīng)濟(jì)樹木。中華獼猴桃原產(chǎn)自我國，果實富含維生素C，且維生素C在人體中的利用率高達(dá)94%（宋圃菊等，1984），一個成年人每天只攝食一個鮮獼猴桃就可滿足人體對維生素C的需求，因而被譽(yù)為“維C之王”。果實酸甜可口，除了鮮食，還可加工成各種食品和飲料。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，獼猴桃汁能有效抑制麻風(fēng)桿菌，從而明顯改善麻風(fēng)病的臨床癥狀。除此之外，獼猴桃汁所含的一種抗突變成分谷胱甘肽，可抑制誘發(fā)致癌基因的突變，并有效阻斷致癌物質(zhì)亞硝酸基嗎啉的合成，從而防止癌癥的發(fā)生（《湖北林業(yè)科技》編輯部，2007）。

WUSCHEL（WUS）相關(guān)同源框（WOX）蛋白家族成員特異存在于植物中，在莖頂端分生組織、根頂端分生組織和形成層中干細(xì)胞的維持和增殖等生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析，模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中15個WOX轉(zhuǎn)錄因子被分為以ATWOX10，13，14在內(nèi)的遠(yuǎn)古進(jìn)化支，以ATWOX8，9，11，12在內(nèi)的中間進(jìn)化支，和以WUS，ATWOX1-7在內(nèi)的現(xiàn)代進(jìn)化支/WUS進(jìn)化支（高麗等，2015）。其中，遠(yuǎn)古進(jìn)化支起源于藻類植物，中間進(jìn)化支起源于維管植物，現(xiàn)代進(jìn)化支起源于種子植物（Lian et al.，2014）。隨著對WOX轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，WOX蛋白家族在各個植物生長發(fā)育中的功能及其作用機(jī)理逐漸明確，特別是在模式植物擬南芥中，大多數(shù)WOX蛋白成員的功能及作用機(jī)理都已明確。ATWOX1的過度表達(dá)導(dǎo)致擬南芥分生組織發(fā)育和多胺穩(wěn)態(tài)的缺陷（Zhang et al.，2011）。ATWOX2和ATWOX8在卵細(xì)胞和合子中共表達(dá)，但由于其不對稱分裂分別僅局限于合子的頂端和基部子細(xì)胞（Lie et al.，2012）。ATWOX3調(diào)控旁側(cè)器官（葉和花）的發(fā)育，其突變體會出現(xiàn)花瓣缺失或變窄（Shimizu et al.，2008）。ATWOX4涉及形成層中維管束的干細(xì)胞的維持。ATWOX5在根尖靜止中心特異性表達(dá)，主要維持根尖分生組織（RAM）中干細(xì)胞的活性（Haecker，2004）。ATWOX6主要在胚珠中表達(dá)，在珠被和卵細(xì)胞的形成過程中可防止細(xì)胞提前分化，進(jìn)而調(diào)控胚珠的生長發(fā)育（Park SO，2005）;Zhu et al.（2004）指出ATWOX6可影響冷脅迫的應(yīng)答。ATWOX9可識別發(fā)育信號并調(diào)控細(xì)胞周期（Wu et al.，2005）。ATWOX10的具體作用雖未明確，但已有研究發(fā)現(xiàn)ATWOX10可能受到光信號、生長素、赤霉素和脫落酸等植物激素以及脅迫等多種信號途徑的協(xié)同作用（王占軍等，2017）。ATWOX11和ATWOX12共同影響外植體根的發(fā)育（Liu et al.，2014）。ATWOX13和ATWOX14在根部及花藥中表達(dá)，主要防止其提前分化（Deveaux et al.，2008）。

關(guān)于植物基因組中的WOX基因家族鑒定和生物信息學(xué)分析的報道較多。利用隱馬爾科夫模型對番茄（Solanum lycopersicum）基因組進(jìn)行WOX基因家族鑒定并發(fā)現(xiàn)有10個WOX基因成員，同時分析其WOX蛋白結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（李曉旭等，2016）。蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）和石斛蘭（Dendrobium catenatum）基因組中分別含有14個和10個WOX基因成員，其中，蝴蝶蘭有3個WOX基因成員出現(xiàn)基因重復(fù)，而在石斛蘭基因組中沒有出現(xiàn)WOX基因重復(fù)（Ramkumar et al.，2018）。茶樹（Camellia sinensis）基因組中有18個WOX基因成員，且其系統(tǒng)進(jìn)化樹分為3組，分別是古老分支、中間分支和現(xiàn)代分支三類（Wang et al.，2019）。在甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)基因組序列中分別鑒定出52、25、29個WOX基因成員（Li et al.，2019）。大豆（Glycine max）基因組中含有33個WOX基因成員，并定位在19條染色體上，而16號染色體沒有WOX基因（Hao et al.，2019）。對毛白楊（Populus tomentosa）的PtoWUSa、PtoWOX4a和PtoWOX5a三個基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了詳細(xì)分析（李建波，2017;王爽等，2019）。在玉米（Zea mays）基因組中鑒定出31個WOX基因成員，且分析了其編碼蛋白的理化特性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（鄭玲等，2019）。毛竹（Phyllostachys heterocycla）基因組中有27個WOX基因成員（李晨曦等，2016），而在其他竹類植物基因組中，俄莉竹（Olyra latifolia）有12個WOX基因成員，Raddia guianensis含有9個WOX基因成員，瓜多竹（Guadua angustifolia）含有18個WOX基因成員以及蕓香竹（Bonia amplexicaulis）含有26個WOX基因成員（Li et al.，2020）。在葡萄（Vitis vinifera）基因組中鑒定出10個WOX基因成員，且其與擬南芥的進(jìn)化樹分為祖先分支、中間分支和現(xiàn)代分支三類（王鵬飛等，2018）。小麥（Triticum aestivum）基因組中含有80個WOX基因成員，其中定位在A、B、D基因組上的分別有23、26、29個，另有2個WOX基因成員定位不明確（李仲卿，2018）。蘋果（Malus pumila）基因組中含有12個WOX基因成員，且在果實中的表達(dá)含量較高（王楚堃等，2020）。小桐子（Jatropha curcas）基因組中有12個WOX基因成員，且在不同組織中的表達(dá)呈顯著性差異（唐躍輝等，2019）。棉花（Gossypium hirsutum）基因組中有37個WOX基因成員，其中，26個WOX基因在棉花根、莖、葉、花等器官中都有表達(dá)（呂有軍等，2017）。簸箕柳（Salix suchowensis）基因組中被鑒定出15個WOX基因成員，且定位在20條染色體上（Wang et al.，2019）。在人參（Panax ginseng）基因組中鑒定出10個WOX基因成員（Liu et al.，2019）。雖然關(guān)于植物基因組中WOX基因家族的鑒定、功能分析的研究較多，但對于中華獼猴桃基因組中WOX基因家族的鑒定及其分子功能研究的文獻(xiàn)報道較少。

關(guān)于中華獼猴桃基因組中轉(zhuǎn)錄因子的研究報道有R1R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)其干旱脅迫反應(yīng)（Ya et al.，2019），EIN3/EIL轉(zhuǎn)錄因子的鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化及其基因表達(dá)分析（陳強(qiáng)等，2018），MADS-box轉(zhuǎn)錄因子與中華獼猴桃乙烯促成熟相關(guān)（Mcatee et al.，2015），還有bZIP家族的相關(guān)報道（于豐源等，2020），但未見中華獼猴桃基因組中WOX轉(zhuǎn)錄因子鑒定和生物信息學(xué)研究的報道。為研究中華獼猴桃WOX基因家族編碼蛋白質(zhì)的分子功能及其在生長發(fā)育過程中的作用如何和非生物脅迫條件下的應(yīng)激反應(yīng)如何。本研究擬對中華獼猴桃16個WOX基因成員進(jìn)行理化特性、亞細(xì)胞定位、蛋白高級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化等詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，為后續(xù)進(jìn)一步研究中華獼猴桃的生長發(fā)育和分子功能等提供一定的參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

中華獼猴桃的16個WOX轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列來自于PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫，并通過該數(shù)據(jù)庫下載與中華獼猴桃WOX轉(zhuǎn)錄因子成員Achn172381同源的番茄、矮牽?；ǎ≒etunia inflata）、辣椒（Capsicum annuum）、擬南芥、油菜（Brassica napus）、葡萄、菠菜（Spinacia oleracea）、大豆、菠蘿（Ananas comosus）、小麥、毛竹、玉米、水稻（Oryza rufipogon）、花生（Arachis hypogaea）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）的WOX轉(zhuǎn)錄因子成員的蛋白序列用于不同物種間WOX轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析研究。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)分析 利用在線程序ProtParam （https：//web.expasy.org/protparam/）對中華獼猴桃的WOX基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析，包括分子量、氨基酸數(shù)、等電點(diǎn)、帶負(fù)電荷殘基數(shù)、帶正電荷殘基數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪指數(shù)，以及親疏水性的預(yù)測分析。并利用數(shù)據(jù)庫PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php）進(jìn)行Blastp，分別找出中華獼猴桃16個WOX轉(zhuǎn)錄因子在模式植物擬南芥對應(yīng)的基因。通過Cell-PLoc2.0 （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ Cell-PLoc-2/）對該家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.2.2 保守結(jié)構(gòu)域、信號肽的分析及跨膜域的預(yù)測 利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測WOX蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;利用SignalP4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析WOX蛋白的信號肽;在TMHMM Severv.2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線程序輸入中華獼猴桃16個WOX轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行跨膜域預(yù)測分析。

1.2.3 磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測分析 通過在線工具NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對中華獼猴桃的WOX轉(zhuǎn)錄因子潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.4 二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測 使用SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對中華獼猴桃WOX轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析;利用在線工具SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對其蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.5 保守基序分析 利用在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.org/tools/meme）對中華獼猴桃的WOX蛋白家族進(jìn)行保守基序分析，參數(shù)設(shè)置：motifs的數(shù)值設(shè)為10，其余參數(shù)默認(rèn)。

1.2.6 序列的多重比對及進(jìn)化樹的構(gòu)建 利用中華獼猴桃的Achn172381蛋白序列在PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp，分別找到番茄、辣椒、油菜、葡萄、玉米、擬南芥等其他15物種中的同源蛋白序列，并分別下載下來。通過軟件MEGA-X（Sudhir et al.，2018）中的ClutalW比對功能對中華獼猴桃的Achn172381蛋白序列與擬南芥等其他15種植物的同源蛋白序列進(jìn)行多重比對，參數(shù)默認(rèn);并用鄰接法（nerghbor-join，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap replications值設(shè)定為1 000。

1.2.7 中華獼猴桃在不同生長發(fā)育時期的WOX基因表達(dá)分析 中華獼猴桃授粉后20、120、127 d的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)下載于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫（SRA No.SRA065642）（Huang et al.，2013），利用Tang et al.（2016）對該轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋分析其授粉20、120、127 d后的表達(dá)譜結(jié)果，通過篩選中華獼猴桃WOX基因家族的16個基因成員表達(dá)水平FPKM值分析其WOX基因表達(dá)水平情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華獼猴桃WOX蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam預(yù)測分析中華獼猴桃16個WOX轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)，分析結(jié)果顯示中華獼猴桃WOX轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸范圍為138（Achn107771）～371（Achn363401）;分子量大小范圍為16.222（Achn107771）～42.185 kD（Achn363401）;等電點(diǎn)為5.14（Achn362341）～9.79（Achn141001），其中，Achn053291、Achn362341、Achn104531、Achn362451、Achn145561的等電點(diǎn)均小于7，它們可能編碼弱酸性蛋白，在酸性亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用;不穩(wěn)定指數(shù)為46.01～74.15，表明均為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定指數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白）;脂肪指數(shù)為44.53（Achn053291）～79.49（Achn141001），說明蛋白成員間熱穩(wěn)定性差異較大。負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp + Glu）為13（Achn107771）～37（Achn362451），正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg + Lys）為14（Achn107771）～42（Achn363401），其中，除Achn053291、Achn362341、Achn104531、Achn362451、Achn145561這5個成員的負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)大于正電荷的氨基酸殘基總數(shù)外，其余13個WOX蛋白成員的正電荷的氨基酸殘基總數(shù)大于負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)。亞細(xì)胞定位分析表明，中華獼猴桃的16個WOX蛋白成員均位于細(xì)胞核（表1）。

根據(jù)各個WOX蛋白成員的氨基酸組成不同，主要分為a、b、c、d、e 五類：a類以絲氨酸為主，包括Achn172381、Achn220151、Achn285781、Achn207451、

Achn053291、Achn104531、Achn145561、Achn172571、Achn362341、Achn141001這10個成員，其中Achn053291絲氨酸的含量最高，為15.20%;b類中僅有Achn362451這1個成員，其氨基酸組成以絲氨酸和谷氨酰胺為主，絲氨酸和谷氨酰各占9.30%;c類以亮氨酸為主，包括Achn131681、Achn107771、Achn336591這3個成員，其中Achn107771亮氨酸最高，占10.90%;d類中以亮氨酸和蘇氨酸為主，僅含Achn299661這1個成員，亮氨酸和蘇氨酸各占10.40%;e類中以蘇氨酸為主，只含Achn363401這1個成員，蘇氨酸占為11.10%（圖1）。

對中華獼猴桃WOX轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行氨基酸親疏水性Protscole預(yù)測發(fā)現(xiàn)中華獼猴桃的16個WOX蛋白成員的GRAVY值均為負(fù)，即這16個成員均為親水蛋白。其中總平均親水指數(shù)最大的為Achn053291，其值為-0.954，該成員的第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14位氨基酸表現(xiàn)為最大親水性，其值為-3.5;第152位氨基酸表現(xiàn)為最大疏水性，其值為1.533。總平均親水指數(shù)最小的是Achn104531，其值為-0.402，該成員的第84、第85、第86位氨基酸表現(xiàn)為最大親水性，其值為-3.567;第250位氨基酸表現(xiàn)為最大疏水性，其值為2.5（表2，圖2）。

2.2 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測、信號肽的分析及跨膜域的預(yù)測分析

中華獼猴桃的16個WOX轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明中華獼猴桃的16個WOX轉(zhuǎn)錄因子中，僅Achn145561有Homodomain superfamily和PIG-H superfamily兩個保守結(jié)構(gòu)域，其余15個WOX蛋白成員只含Homodomain superfamily這一個保守結(jié)構(gòu)域。中華獼猴桃WOX蛋白成員的保守結(jié)構(gòu)域長度為38～61，其中，Achn172381、Achn131681、Achn299661、Achn363401這4個成員的保守結(jié)構(gòu)域等長，均為59，但位置各異;Achn207451與Achn053291的保守結(jié)構(gòu)域等長，均為60，且位置吻合;Achn362341與Achn104531的保守結(jié)構(gòu)域長度和位置均吻合;Achn362451與Achn145561中的Homodomain superfamily保守結(jié)構(gòu)域等長，均為58，但位置不同（表3，圖3）。

SignalP4.1 Server信號肽預(yù)測分析結(jié)果顯示除Achn141001外，其余15個中華獼猴桃轉(zhuǎn)錄因子均無信號肽。因此，推測Achn141001為分泌蛋白，其余均為非分泌蛋白（圖4）。TMHMM Severv.2.0跨膜域分析結(jié)果顯示，除Achn362451、Achn141001有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域外，其余14個WOX轉(zhuǎn)錄因子均無明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域。因此，推測Achn362451、Achn141001為跨膜蛋白（圖5）。

2.3 磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測分析

NetPhos 3.1磷酸化位點(diǎn)分析表明16個WOX蛋白成員中，Achn172381、Achn336591、Achn285781、Achn207451、Achn053291等13個WOX蛋白成員中磷酸化位點(diǎn)的總數(shù)：絲氨酸>蘇氨酸>酪氨酸;Achn131681和Achn299661中磷酸化位點(diǎn)總數(shù)：蘇氨酸>絲氨酸>酪氨酸;Achn363401中磷酸化位點(diǎn)總數(shù)：絲氨酸=蘇氨酸>酪氨酸。就單個成員而言，除Achn299661的潛在磷酸化位點(diǎn)為蘇氨酸外，其余15個WOX蛋白成員潛在磷酸化位點(diǎn)均為絲氨酸。在16個WOX蛋白成員中，極易在絲氨酸處磷酸化的成員為Achn207451、Achn053291、Achn172571（0.998），極易在蘇氨酸處磷酸化的成員為Achn362341和Achn104531（0.995），極易在酪氨酸處磷酸化的成員為Achn362451（0.978）（表4，圖6）。

2.4 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析

使用SOPMA程序?qū)χ腥A獼猴桃WOX轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果顯示，大部分WOX蛋白成員的二級結(jié)構(gòu)都以無規(guī)則卷曲為主，其次為α-螺旋和延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角含量最少。其中，Achn172381、Achn131681、Achn299661、Achn336591、Achn285781等12個成員的二級結(jié)構(gòu)含量為無規(guī)則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角;Achn220151、Achn220151和Achn104531三個成員的二級結(jié)構(gòu)含量為無規(guī)則卷曲>延伸鏈>α-螺旋>β-轉(zhuǎn)角;Achn141001的二級結(jié)構(gòu)含量為無規(guī)則卷曲=α-螺旋>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角。α-螺旋在成員中占比為12.79%（Achn362341）～42.00%（Achn362451）;延伸鏈在成員中占比為4.00%（Achn362451）～21.18%（Achn104531）;β-轉(zhuǎn)角在成員中占比為2.38%（Achn172381）～9.49%（Achn141001）;無規(guī)則卷曲在成員中占比為69.38%（Achn362341）～37.34%（Achn141001）（表5，圖7）。

通過在線工具SWISS-MODEL對中華獼猴桃WOX轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，16個WOX蛋白成員的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)可分為11類。Achn172381與Achn220151為一類，其代表為Achn220151;Achn131681與Achn336591為一類，其代表為Achn131681;Achn207451、Achn053291、Achn172571為一類，其代表為Achn053291;Achn362341與Achn104531為一類，其代表為Achn362341;Achn299661、Achn285781、Achn363401、Achn362451、Achn145561、Achn107771、Achn141001各代表一類（圖8）。

2.5 保守基序分析

利用在線工具M(jìn)EME對中華獼猴桃的WOX家族進(jìn)行保守基序分析，結(jié)果表明：motif1出現(xiàn)在中華獼猴桃的所有的WOX蛋白成員中，motif2出現(xiàn)在除Achn107771和Achn141001外的其他WOX蛋白成員中。根據(jù)不同成員中所含motif不同，將中華獼猴桃的16個WOX蛋白成員分為A、B、C三個組。A組主要含motif1、motif2、motif3、motif5和motif10的蛋白成員有Achn104531與Achn362341，只含motif1、motif2、motif3和motif5的有Achn362451與Achn145561，只含motif1、motif2、motif3和motif10的有Achn220151;B組主要含motif1、motif2、motif4、motif7、motif8和motif9的有Achn131681與Achn336591，只含motif1、motif2、motif7和motif9的有Achn299661，只含motif1、motif2和motif4的有Achn172381與Achn363401;C組主要含motif1、motif2、motif4和motif6的有Achn285781與Achn172571，含有motif1、motif2、motif4和motif7的有Achn053291與Achn207451，只含motif1和motif4的有Achn141001，只含motif1的為Achn107771（圖9）。

2.6 中華獼猴桃WOX基因家族在不同時期的表達(dá)水平分析

通過對中華獼猴桃授粉后20、120、127 d的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其WOX基因家族中Achn131681、Achn145561、Achn336591和Achn362451成員在中華獼猴桃授粉后20 d的基因表達(dá)水平顯著提高，成員Achn362451在中華獼猴桃16個WOX基因成員中表達(dá)含量最高。在授粉后120 d，成員Achn131681、Achn145561和Achn362451基因表達(dá)水平顯著提高，Achn362451表達(dá)含量最高。在授粉后127 d，成員Achn145561和Achn362451的表達(dá)含量較高，且Achn362451表達(dá)含量在所有WOX基因中表達(dá)含量中最高。從中華獼猴桃授粉后20、120、127 d的生長發(fā)育成熟過程來看，成員Achn131681基因表達(dá)水平是先上升后下降;成員Achn145561基因表達(dá)水平一直上升，在授粉后127 d達(dá)最高水平;成員Achn336591基因表達(dá)水平是先上升后下降，在授粉后127 d幾乎不表達(dá);成員Achn362451基因表達(dá)水平是先上升后下降，但在授粉127 d后表達(dá)含量也較高。而除以上4個基因成員外，其他12個WOX基因在其授粉后20、120、127 d表達(dá)含量很低甚至不表達(dá)（圖10）。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

中華獼猴桃與擬南芥WOX轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，其進(jìn)化樹分為三大分支，與擬南芥的三大進(jìn)化支即遠(yuǎn)古進(jìn)化支、中間進(jìn)化支和現(xiàn)代進(jìn)化支/WUS進(jìn)化支相吻合。因此，推測Achn145561和Achn362451為古代進(jìn)化支，Achn220151、Achn362341、Achn104531為中間進(jìn)化支，Achn172381、Achn107771、Achn285761、Achn172571、Acn299661、Achn131681、Achn336591、Achn363401、Achn207451、Achn053291、Achn141001為現(xiàn)代進(jìn)化支，即WUS進(jìn)化支（圖11）。

對中華獼猴桃、擬南芥、番茄等16種植物的WOX基因家族的蛋白序列進(jìn)行多重比對并構(gòu)建進(jìn)化樹。其進(jìn)化樹可分為GroupⅠ、GroupⅡ、Group Ⅲ三組，分別包括番茄、辣椒、矮牽?；?、擬南芥、油菜、葡萄、菠菜、大豆在內(nèi)的Group I，包括中華獼猴桃、菠蘿、玉米、水稻、小麥以及毛竹在內(nèi)的Group Ⅱ，包括馬鈴薯及花生在內(nèi)的Group Ⅲ。分支的遠(yuǎn)近及距離長短表明，中華獼猴與菠蘿的親緣關(guān)系最近，與番茄的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖12）。

3 討論與結(jié)論

本研究對中華獼猴桃的16個WOX轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測、磷酸化位點(diǎn)、保守基序、二級結(jié)構(gòu)分析、三級結(jié)構(gòu)分析和進(jìn)化樹等詳細(xì)生物信息學(xué)分析。王楚堃等（2019）對蘋果WOX轉(zhuǎn)錄因子研究發(fā)現(xiàn)蘋果中WOX蛋白成員的氨基酸數(shù)量為176～381，分子量為20.122～45.337 kD。李雪垠等（2019）對谷子和狗尾草WOX轉(zhuǎn)錄因子研究發(fā)現(xiàn)，谷子中WOX蛋白成員的氨基酸數(shù)量為212～533，分子量為20.011～54.998 kD;狗尾草中WOX蛋白成員的氨基酸數(shù)量為212～531，分子量為23.969～54.788 kD。郭亞靜等（2020）對星油藤WOX轉(zhuǎn)錄因子的研究中發(fā)現(xiàn)星油藤WOX蛋白成員氨基酸數(shù)量為220～420，分子量為24.95～45.37 kD。同時，在對小桐子（唐躍輝等，2019）、番茄（李曉旭等，2016）、棉花（呂有軍等，2017）、烏拉爾圖小麥（單強(qiáng)強(qiáng)等，2019）、玉米（鄭玲等，2019）、簸箕柳（Wang et al.，2019）、蒺藜苜蓿和鷹嘴豆（張洪濤，2018）中WOX蛋白成員的研究中發(fā)現(xiàn)，其WOX蛋白成員的氨基酸數(shù)量和分子量差異很大。其中，對棉花（呂有軍等，2017）、蘋果（王楚堃等，2019）和烏拉爾圖小麥（單強(qiáng)強(qiáng)等，2019）WOX蛋白成員進(jìn)行穩(wěn)定性和親疏水性預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)其WOX蛋白成員均為不穩(wěn)定的親水蛋白，張洪濤等（2018）對蒺藜苜蓿和鷹嘴豆WOX蛋白成員的親疏水性分析發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿和鷹嘴豆中WOX蛋白成員均為親水蛋白。本研究結(jié)果表明，中華獼猴桃的16個WOX蛋白成員氨基酸數(shù)量為138～371，分子量為16.222～42.185 kD的不穩(wěn)定親水蛋白。結(jié)合前人以及本研究中WOX蛋白質(zhì)理化特性分析結(jié)果可以推測植物大部分WOX蛋白成員的氨基酸數(shù)量和分子量差異性很大且為不穩(wěn)定的親水蛋白。對烏拉爾圖小麥（單強(qiáng)強(qiáng)等，2019）、玉米（鄭玲等，2019）、鷹嘴豆（張洪濤，2018）、簸箕柳（Wang et al.，2019）、谷子和狗尾草（李雪垠等，2019）基因組中的WOX蛋白理化特性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其大部分WOX蛋白成員為定位在細(xì)胞核的堿性蛋白，而在蒺藜苜蓿（張洪濤，2018）、棉花（呂有軍等，2017）、蘋果（王楚堃等，2019）、星油藤（郭亞靜等，2020）中WOX蛋白成員以酸性蛋白為主，在番茄的WOX蛋白成員中酸性蛋白和堿性蛋白各占一半。棉花WOX轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞預(yù)測結(jié)果顯示，棉花中的WOX蛋白成員大部分定位于細(xì)胞質(zhì)和微體，少部分定位于細(xì)胞核。中華獼猴桃的WOX蛋白成員大多為定位于細(xì)胞核的堿性蛋白，極少數(shù)為定位于細(xì)胞核的酸性蛋白。此結(jié)果與烏拉爾圖小麥、玉米鷹嘴豆、簸箕柳、谷子中WOX蛋白成員的分析結(jié)果有相似之處，但由于缺少具體實驗數(shù)據(jù)的支撐，暫不能得出WOX蛋白成員中亞細(xì)胞定位與酸堿性的關(guān)系結(jié)論，但可以推測不同的物種中WOX蛋白成員由于發(fā)揮的功能不同造成其WOX蛋白成員的亞細(xì)胞定位和酸堿性也會有所差異。由氨基酸組成來看，中華獼猴桃中16個WOX蛋白成員主要以絲氨酸為主，其次為亮氨酸、蘇氨酸和谷氨酰胺，而在其他物種中對WOX蛋白成員的氨基酸組成分析尚未見報道。

保守結(jié)構(gòu)域分析表明，中華獼猴桃的16個WOX轉(zhuǎn)錄因子均屬于Homodomain superfamily，此結(jié)果與玉米（鄭玲等，2019）、番茄（李曉旭等，2016）、葡萄（王鵬飛等，2018）等研究結(jié)果一致，在玉米（鄭玲等，2019）、番茄（李曉旭等，2016）、葡萄（王鵬飛等，2018）等研究中，所有的WOX蛋白成員都含有homeobox這一結(jié)構(gòu)域。信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域顯示，在中華獼猴桃中，大多數(shù)成員無跨膜區(qū)和信號肽，僅Achn362451是分泌蛋白，且僅Achn362451和Achn141001具有跨膜區(qū)，為跨膜蛋白。而在陸地棉花（呂有軍等，2017）中，所有的WOX都不含跨膜區(qū)和信號肽。故推測大多數(shù)WOX蛋白成員為非跨膜蛋白或非分泌蛋白。

中華獼猴桃大多數(shù)WOX蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，其次為α-螺旋和延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角含量最少。此結(jié)果與陸地棉中WOX轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)含量預(yù)測結(jié)果相似（呂有軍等，2017;Hao et al.，2019）。保守基序分析結(jié)果顯示，中華獼猴桃中所有的WOX蛋白成員均含有motif1。李曉旭等（2016）對番茄的WOX基因家族研究中發(fā)現(xiàn)所有成員都含有motif1，并指出motif1是由60個氨基酸殘基組成的保守的同源異型結(jié)構(gòu)域homeodomain。王鵬飛等（2018）在葡萄的WOX基因家族研究中發(fā)現(xiàn)所有WOX蛋白成員均含有motif1和motif2，并進(jìn)一步分析指出這兩個結(jié)構(gòu)域序列是包含WOX蛋白的homeobox結(jié)構(gòu)域的序列。王楚堃等（2019）在蘋果WOX基因家族研究中發(fā)現(xiàn)，其WOX所有蛋白成員均含motif1，且motif1結(jié)構(gòu)域包含WOX家族homeobox的結(jié)構(gòu)域序列。李晨曦等（2016）在毛竹WOX基因家族研究中發(fā)現(xiàn)，所有WOX蛋白成員都含有motif1和motif3，且指出motif1和motif3共同組成了homeodamin。本研究的中華獼猴桃WOX蛋白基序分析結(jié)果與以上這些植物基因組中WOX蛋白的保守基序分析結(jié)果相似，故推測中華獼猴桃中motif1在所有基序中最為保守，可能包含有WOX蛋白的homeobox結(jié)構(gòu)域序列。

系統(tǒng)進(jìn)化研究揭示了中華獼猴桃的16個WOX蛋白成員被分為遠(yuǎn)古進(jìn)化支、中間進(jìn)化支和現(xiàn)代進(jìn)化支。此結(jié)果與番茄、棉花、玉米、蘋果、葡萄、烏拉爾圖小麥、星油藤、歐洲油菜（Li et al.，2019）、人參（Liu et al.，2019）、玫瑰和野薔薇、蒺藜苜蓿和鷹嘴豆中構(gòu)建的WOX進(jìn)化樹的分支相同，但與毛竹構(gòu)建的WOX進(jìn)化樹不同。李晨曦等（2016）在構(gòu)建的毛竹WOX進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)，其WOX蛋白成員分為現(xiàn)代/WUS進(jìn)化分支和古老進(jìn)化支，并指出由于缺少與10個擬南芥對應(yīng)同源基因，且不含中間進(jìn)化支，故與一般種子植物含有的3個分支不同。在中華獼猴桃與其他15個物種構(gòu)建的進(jìn)化樹中，中華獼猴與菠蘿的親緣關(guān)系最近，與番茄的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。中華獼猴桃授粉后20、120、127 d的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析結(jié)果表明，其Achn131681、Achn145561、Achn336591和Achn362451基因表達(dá)水平顯著提高，Achn131681、Achn336591和Achn362451基因表達(dá)水平呈先上升后下降的趨勢，而Achn145561基因表達(dá)水平一直上升，除了這4個WOX基因外，中華獼猴桃其他12個WOX基因在其生長發(fā)育及其成熟過程中表達(dá)含量很低甚至不表達(dá)。本研究為進(jìn)一步研究中華獼猴桃WOX轉(zhuǎn)錄因子的分子功能提供了一定的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 李 莉）