盧來順，林雪瓊，曾蕓珠

(1．汕頭市中心醫(yī)院超聲診斷科，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，廣東 汕頭 515041；3．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515041)

食管癌是全球常見的惡性腫瘤，我國是全球食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家之一，每年平均新發(fā)病例數(shù)約22.3萬，死亡人數(shù)約15萬[1]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，淋巴源性轉(zhuǎn)移是食管癌轉(zhuǎn)移的主要途徑和影響其預(yù)后因素之一[2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)是促進(jìn)淋巴管生成的重要因素[3-4]，亦有大量報道VEGF-C、VEGFR-3在食管鱗癌中的表達(dá)。然而，暫未查閱到有關(guān)VEGF-C、VEGFR-3與多種蛋白表達(dá)及其與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系的報道。本文旨在探討VEGFC、VEGFR-3蛋白表達(dá)與食管癌臨床病理特征、患者預(yù)后的關(guān)系及其與凋亡抑制蛋白Survivin等蛋白的關(guān)系，進(jìn)一步明確VEGF-C、VEGFR-3在食管癌診治中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2014年5月—2016年4月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科收檢的部分食管癌手術(shù)標(biāo)本134例。其中男性108例，女性26例；年齡43～78歲，平均年齡(59.99±7.79)歲，中位年齡60歲。根據(jù)第八版食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期11例，Ⅲ期98例，Ⅳ期16例。其中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84例。選取食管癌切除術(shù)后恢復(fù)良好出院的病例進(jìn)行跟蹤隨訪，隨訪時間截止到2018年5月，隨訪時間7～36個月。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗試劑

兔抗人VEGF-C多克隆抗體、鼠抗人VEGFR-3單克隆抗體均購于北京中杉金橋生物公司，兔抗人Survivin多克隆抗體、兔抗人EGFR單克隆抗體、兔抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體、即用型免疫組化MaxVision二抗及DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物公司。

1.3 實驗方法

標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)制片、HE染色。免疫組化染色步驟按EnVision兩步法進(jìn)行：石蠟標(biāo)本3 μm厚連續(xù)切片，65℃烤片1 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各2 min，PBS洗3次，3 min/次，3%H2O210 min，抗原修復(fù)(VEGF-C、Ki-67、p53采用pH=6.0，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)；VEGFR-3、EGFR采用pH=9.0 EDTA高溫修復(fù))，PBS洗3次，3 min/次，加1滴一抗37℃孵育1 h，PBS洗3次，3 min/次，加1滴二抗室溫15 min，PBS洗3次，3 min/次，加1滴DAB顯色5 min，流水終止顯色，蘇木精復(fù)染1 min，分化，返藍(lán)，脫水，透明，中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果判斷

蛋白表達(dá)均以細(xì)胞著色情況為標(biāo)準(zhǔn)，陽性染色為棕黃色，凡顯色強(qiáng)度與背景無明顯差別為陰性。先在低倍鏡下選取最強(qiáng)著色區(qū)，然后選10個高倍鏡視野(400×)，分別計數(shù)100個細(xì)胞，按其出現(xiàn)特異性染色顏色深淺參考文獻(xiàn)評分[5-7]：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按染色細(xì)胞所占百分比計分：陰性為0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分，10%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：≥3分為陽性，其中3～4分為(+)，5～7分為(++)，8～9分為(+++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗；VEGFC、VEGFR-3表達(dá)與4種常見蛋白的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)檢驗；VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)與患者生存時間的關(guān)系，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素生存分析采用Cox風(fēng)險比例回歸模型法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中的蛋白表達(dá)

VEGF-C、VEGFR-3蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和癌巢周圍間質(zhì)細(xì)胞，呈棕黃色顆粒狀，灶性或彌漫性分布，多出現(xiàn)在癌巢的邊緣部位(圖1A、圖1B)；Survivin蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核中也有少量表達(dá)(圖1C)；EGFR蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)/膜中表達(dá)(圖1D)；Ki-67、p53蛋白定位于細(xì)胞核(圖1E、圖1F)。

圖1 食管癌組織中的蛋白表達(dá) (MaxVisionTM法，×200)

2.2VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

134例食管癌標(biāo)本中，VEGF-C蛋白陽性105例(78.36%)，VEGFR-3 蛋白陽性 92 例(68.66%)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的VEGF-C陽性率分別為88.10%(74/84)和62.00%(31/50)，VEGFR-3陽性率分別為77.40%(65/84)和54.00%(27/50)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)越多，VEGF-C、VEGFR-3陽性率越高。VEGF-C表達(dá)與腫瘤浸潤深度有關(guān)(P＜0.05)，VEGFR-3表達(dá)與腫瘤浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)；兩者表達(dá)與患者性別、年齡、神經(jīng)束是否浸潤、腫瘤分化程度均不相關(guān)(P＞0.05，表1)。

表1 VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 食管癌組織中VEGF-C、VEGFR-3與Survivin、EGFR、Ki-67、p53表達(dá)的相關(guān)性

VEGF-C、VEGFR-3與Survivin的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)，而與EGFR、Ki-67、p53的表達(dá)無關(guān)(P＞0.05，表2)。

表2 食管癌組織中VEGF-C、VEGFR-3與Survivin、EGFR、Ki-67、p53表達(dá)的相關(guān)性

2.4VEGF-C、VEGFR-3蛋白表達(dá)與食管癌患者生存時間的關(guān)系

在134例食管癌患者中，44例患者隨訪期間死亡，90例患者隨訪至2018年5月仍生存。單因素分析發(fā)現(xiàn)，VEGF-C低表達(dá)患者中位生存期長于高表達(dá)者(32.670個月vs 28.215個月，P=0.049，圖2)；VEGFR-3低表達(dá)患者中位生存期亦長于高表達(dá)者(32.183個月vs 27.630個月，P=0.025，圖3)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與食管癌患者的生存時間密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004，圖4)。將VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)及各臨床病理特征導(dǎo)入Cox回歸模型進(jìn)行多因素生存分析，結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測因子 (OR=2.297，95%CI： 1.031～5.118，P=0.042)，但VEGF-C、VEGFR-3不是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測因子(OR=1.921，95%CI：0.640～5.764，P=0.244 和 OR=1.515， 95%CI： 0.663～3.462， P=0.325)。

圖2 VEGF-C蛋白不同表達(dá)的食管癌患者的生存曲線

圖3 VEGFR-3蛋白不同表達(dá)的食管癌患者的生存曲線

圖4 淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移的食管癌患者的生存曲線

3 討論

腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因，而在腫瘤轉(zhuǎn)移這一因素中，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要原因[8]，淋巴源性轉(zhuǎn)移是食管癌轉(zhuǎn)移的主要途徑和影響預(yù)后的因素之一。VEGF-C是血管內(nèi)皮生長因子家族成員之一，通過酪氨酸激酶受體VEGFR-3促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和淋巴管生成，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在胃癌[9]和乳腺癌[10-11]等多種腫瘤的研究中已得到證實。本組實驗應(yīng)用免疫組化法對134例食管癌VEGF-C、VEGFR-3的表達(dá)進(jìn)行檢測，陽性率分別為78.36%、68.66%，這與既往研究食管鱗癌中表達(dá)陽性率比較一致[12]。本研究表明VEGF-C、VEGFR-3的表達(dá)與食管癌的淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

食管癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，在分子水平上涉及眾多癌基因、抑癌基因及蛋白質(zhì)的改變。Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員[13]，具有抑制腫瘤凋亡、促進(jìn)腫瘤異常增殖等特點(diǎn)，與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。Yan等[15]研究Survivin表達(dá)與放化療后食管鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，高表達(dá)Survivin的患者預(yù)后不良。乳腺癌中，VEGF-C的表達(dá)水平與Survivin的表達(dá)水平存在顯著相關(guān)，且VEGF-C參與了Survivin介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲過程[14]，本研究結(jié)果顯示VEGF-C、VEGFR-3與Survivin在食管癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。

EGFR是原癌基因C-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長因子受體家族成員之一。EGFR廣泛分布于上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，研究表明EGFR在與其配體結(jié)合后可以引起細(xì)胞生長、增殖和分化，在正常的細(xì)胞生理過程中發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用[16]。EGFR蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異?？纱龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移，以及抑制細(xì)胞凋亡[17]。Ki-67是目前評估腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)之一，可判斷腫瘤侵襲力及預(yù)后[18]。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，p53基因的功能發(fā)生缺陷則可導(dǎo)致人體細(xì)胞異常增殖[19]。p53基因好似“基因組衛(wèi)士”，在G1期檢查DNA損傷點(diǎn)，監(jiān)視基因組的完整性。如果p53基因發(fā)生了突變，對細(xì)胞的增殖失去控制，則導(dǎo)致細(xì)胞癌變[20]。p53蛋白主要分布于細(xì)胞核中，在正常細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平通常低于免疫組化方法的檢出水平，p53基因突變可導(dǎo)致突變型p53蛋白的積聚和過度表達(dá)。既往研究報道，胃癌、卵巢上皮癌中VEGF-C和EGFR的表達(dá)呈正相關(guān)[21-22]，乳腺癌中VEGF、p53、Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)[23]；也有研究顯示食管癌中p53蛋白的表達(dá)與VEGF表達(dá)無密切關(guān)系[24]，田興松等[25]研究發(fā)現(xiàn)EG-1 mRNA在甲狀腺癌組織中的表達(dá)與VEGF-C蛋白顯著相關(guān)，與p53蛋白無相關(guān)性。本研究中VEGF-C、VEGFR-3與EGFR、Ki-67、p53的表達(dá)不相關(guān)。這可能與本研究納入的食管癌標(biāo)本大部分為食管鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)。此外，更多的研究傾向于將蛋白的表達(dá)分為陰性和陽性2個等級，本研究分為4個等級進(jìn)行分析亦可能是影響因素之一。

此外，本組病例進(jìn)行了跟蹤隨訪，結(jié)果顯示VEGF-C、VEGFR-3低表達(dá)患者的中位生存期長于高表達(dá)者。除了VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)外，單因素分析數(shù)據(jù)還提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與食管癌患者的生存時間密切相關(guān)。眾所周知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多過程的，影響其預(yù)后的因素紛繁復(fù)雜，于是我們將VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)及各臨床病理特征導(dǎo)入Cox回歸模型進(jìn)行多因素生存分析，結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測因子，但VEGF-C、VEGFR-3不是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測因子。結(jié)果提示VEGFC、VEGFR-3表達(dá)水平高的患者其死亡風(fēng)險較表達(dá)低的患者大；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其死亡風(fēng)險也越大；VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)越高的食管癌患者，其生存時間越短。

綜上所述，食管癌組織中VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)的高低與患者是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)呈正相關(guān)。VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)越高提示食管癌患者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性越大且預(yù)后越差?？梢酝ㄟ^常規(guī)檢測VEGF-C、VEGFR-3來幫助食管癌的早期診治和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷，評估食管癌患者的預(yù)后。