孫綺思，蘇中靜，2

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院廣東省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041)

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是引起新型冠狀病毒肺炎流行的病原菌，感染SARS-CoV-2的患者可能引發(fā)嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征[1-2]。約翰斯·霍普金斯大學(xué)的疫情追蹤數(shù)據(jù)顯示，截至2021年6月4日，全球累計(jì)新型冠狀病毒肺炎確診病例超17 000萬例，累計(jì)死亡超360萬例。SARS-CoV-2病毒的感染在全球范圍內(nèi)對(duì)人類的生活和生產(chǎn)造成了重大影響，因此研究SARS-CoV-2感染人體的機(jī)制以及病毒與人體細(xì)胞的相互作用備受關(guān)注和重視。

SARS-CoV-2屬于正鏈RNA β型冠狀病毒，核酸長(zhǎng)度約為30 kb，其轉(zhuǎn)錄本有5′帽和3′端多聚A尾結(jié)構(gòu)。SARSCoV-2正鏈RNA至少編碼29種蛋白質(zhì)，其中包含刺突蛋白、小包膜蛋白、膜蛋白和核衣殼蛋白4種結(jié)構(gòu)蛋白，16種非結(jié)構(gòu)蛋白以及9個(gè)假定的輔助蛋白。SARS-CoV-2的正鏈RNA需要宿主細(xì)胞的組件來完成其蛋白質(zhì)的翻譯和運(yùn)輸，并組裝和分泌病毒顆粒，這些蛋白幫助病毒轉(zhuǎn)錄本占據(jù)宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)主導(dǎo)地位，抑制宿主細(xì)胞的正常轉(zhuǎn)錄與翻譯[3-4]。

選擇性剪接指同種mRNA前體通過不同的剪接方式產(chǎn)生多種亞型的過程，所形成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可有不同的結(jié)構(gòu)特性和功能。以往研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞中約60%的基因表達(dá)不同的剪接亞型，提示初始mRNA的選擇性剪接廣泛參與了免疫細(xì)胞的分化和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[5-6]。近期的研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞的同時(shí)伴隨著眾多選擇性剪接事件，它們不僅幫助病毒進(jìn)行高效的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，還使病毒有效地躲避機(jī)體的免疫反應(yīng)[7-8]。本文綜述選擇性剪接在SARS-CoV-2入侵宿主、宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)以及病毒逃避免疫過程中的調(diào)控作用等的相關(guān)研究。

1 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的選擇性剪接可能干預(yù)SARS-CoV-2的入侵

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是Ⅰ型跨膜蛋白，宿主細(xì)胞ACE2與刺突蛋白S1亞基上的受體結(jié)合域結(jié)合，引發(fā)了刺突蛋白的裂解，誘發(fā)膜融合和感染[9]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ACE2基因的5′端、3′端和內(nèi)含子區(qū)域存在可能參與選擇性剪接的假定外顯子，這些外顯子或可取代SARS-CoV-2入侵宿主所需的ACE2結(jié)構(gòu)域，同時(shí)保留ACE2在人體內(nèi)的生理功能。剪接開關(guān)寡核苷酸(splice-switching antisense oligonucleotides，SSOs)是一種可與核內(nèi)前體mRNA的靶序列進(jìn)行堿基配對(duì)的短合成反義序列，ACE2基因的選擇性剪接模型實(shí)驗(yàn)提示有可能通過SSOs的作用，調(diào)控ACE2序列中SARS-CoV-2識(shí)別相關(guān)的選擇性剪接外顯子的表達(dá)，從而干預(yù)SARS-CoV-2對(duì)宿主細(xì)胞的感染[10]。

2 非結(jié)構(gòu)蛋白16調(diào)控宿主mRNA的選擇性剪接

冠狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，Nsp)通常參與病毒遺傳物質(zhì)的翻譯及其產(chǎn)物的折疊和運(yùn)輸，并調(diào)控宿主的蛋白表達(dá)和免疫應(yīng)答[11]。Nsp16是一個(gè)2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，它在Nsp10的協(xié)助下促進(jìn)病毒mRNA帽2′-O甲基化，提高病毒翻譯效率，抑制宿主的mRNA[12-13]。Banerjee等[14]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2基因組編碼的Nsp16與snRNA U1的5′端剪接位點(diǎn)識(shí)別序列和U2的分支點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞的mRNA剪接缺陷。Nsp16作為宿主毒力因子，通過觸發(fā)異常剪接來破壞全局內(nèi)源性mRNA的加工，最終造成宿主細(xì)胞mRNA和蛋白水平的衰退。

3 病毒基因組結(jié)合宿主細(xì)胞RNA結(jié)合蛋白調(diào)控選擇性剪接

RNA結(jié)合蛋白可以結(jié)合mRNA并調(diào)控mRNA的剪接加工或翻譯過程[15]。Srivastava等[16]通過轉(zhuǎn)錄物剪接的復(fù)制多變量分析方法發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2感染細(xì)胞中發(fā)生選擇性剪接事件的基因存在大量跳躍和互斥的外顯子事件，并發(fā)現(xiàn)大量RNA結(jié)合蛋白編碼基因表達(dá)選擇性剪接亞型，它們可能會(huì)改變宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。SRSF1、RNPS1和hnRNP A1都是參與選擇性剪接的RNA結(jié)合蛋白，SRSF1缺失導(dǎo)致的基因組失穩(wěn)可通過RNPS1的過度表達(dá)來糾正[17-18]。Rogan等[18]通過模型預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)SRSF1、RNPS1和hnRNP A1在SARS-CoV-2 RNA上存在許多結(jié)合位點(diǎn)，宿主感染后和病毒基因組之間存在著對(duì)這些RNA結(jié)合蛋白的競(jìng)爭(zhēng)，可能會(huì)改變宿主細(xì)胞全基因組的選擇性剪接。

4 宿主miRNA和病毒miRNA形成雙重機(jī)制參與選擇性剪接

基因組經(jīng)過選擇性剪接生成的多種異構(gòu)體miRNA主要與mRNA 3′端互補(bǔ)結(jié)合、調(diào)控蛋白水平。Sa?ar等[19]預(yù)測(cè)出30個(gè)靶向1 367個(gè)人類基因的病毒成熟miRNA樣序列。Yu等[20]研究發(fā)現(xiàn)病毒miR-200c-3p靶向細(xì)胞ACE2mRNA的3′UTR。SARS-CoV-2感染細(xì)胞中存在大量可能改變轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的選擇性剪接事件，宿主來源的miRNA作為調(diào)節(jié)因子與病毒基因組相互作用參與這些剪接過程[16]。一些人類miRNA可以靶向SARS-CoV-2基因組各區(qū)域，例如，hsamiR-17-5p、hsa-miR-20b-5p和hsa-miR-323a-5p靶向可讀框1ab區(qū)域[21]，miR-374a-3p靶向刺突蛋白基因[16]。7個(gè)與病毒mRNA完全互補(bǔ)的人類miRNA已被鑒定，其中miR-3611、miR-3691-3p和miR1468-5p在可讀框1a上，miR-5197和miR-3934-3p在S區(qū)上，miR-8066和miR-1307-3p在N區(qū)上[22-23]。

病毒來源的miRNA靶向宿主多個(gè)特定通路，劫持宿主miRNA，保護(hù)病毒mRNA免受降解，抑制細(xì)胞凋亡與自噬。而細(xì)胞來源的miRNA吸附病毒mRNA的3'-UTR，導(dǎo)致這些miRNA與宿主mRNA的結(jié)合減少，改變了宿主基因的表達(dá)。兩種來源的miRNA形成作用網(wǎng)絡(luò)對(duì)SARS-CoV-2產(chǎn)生了雙重作用[24]，它們?cè)诟腥炯?xì)胞選擇性剪接過程中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

5 選擇性剪接調(diào)控干擾素刺激基因網(wǎng)絡(luò)的抗病毒作用

有證據(jù)表明，SARS-CoV-2對(duì)干擾素敏感[25]。干擾素與其誘導(dǎo)的干擾素刺激基因(interferon stimulated genes，ISGs)為機(jī)體建立抗病毒狀態(tài)，ISGs在宿主細(xì)胞內(nèi)的選擇性剪接可改變ISGs蛋白的定位和活性[26-27]。Banerjee等[14]模擬經(jīng)干擾素信號(hào)介導(dǎo)的堿性磷酸酶報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)該干擾素應(yīng)答基因在Nsp16的表達(dá)和添加干擾剪接體組裝的小分子時(shí)受到強(qiáng)烈抑制。此外，SARS-CoV-2的mRNA 3′端有大量CpG位點(diǎn)，ISGs編碼的鋅指抗病毒蛋白可靶向這些CpG位點(diǎn)，也可通過產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的鋅指抗病毒蛋白亞型來限制病毒基因組的表達(dá)[28]。

6 小結(jié)

自新冠病毒被鑒定后，許多研究證明了病毒與宿主細(xì)胞之間通過各種相互作用增加其各自的蛋白表達(dá)形式并調(diào)控對(duì)方的基因表達(dá)。病毒Nsp、miRNA、宿主蛋白相互作用調(diào)控宿主基因表達(dá)的多個(gè)剪接環(huán)節(jié)，發(fā)揮協(xié)助病毒感染和增強(qiáng)宿主抗病毒免疫反應(yīng)的作用。目前，備受關(guān)注的是干擾素刺激的下游靶基因網(wǎng)絡(luò)通過選擇性剪接作用抑制病毒的入侵和復(fù)制。在SARS-CoV-2感染過程中，探索這些RNA剪接事件有利于為未來開發(fā)新的治療方法與防控新型冠狀病毒肺炎提供新的思路。