紀鳳娣，魏巍，陶匯源，李東，夏蓉，魯緋*

(1.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

多酚類化合物是植物次生代謝自然合成的化合物，可以在一些天然食物中找到，由于具有潛在的保健治療作用，這類化合物引起了科學界的廣泛關注[1]。適當攝入具有生物活性的多酚類化合物，在預防糖尿病[2]、肥胖癥[3]、帕金森病[4]、阿爾茨海默病[5]等疾病方面具有良好的效果。目前，多酚在與食品、制藥和材料等有關的應用方面有很大的潛力，也是這些領域的創(chuàng)新熱點。

食醋是我國最受歡迎的調味品之一，有著悠久的生產(chǎn)歷史[6]。隨著食醋對人體健康的潛在影響，其在世界范圍內(nèi)引起越來越多的關注，已有許多報道證實各種醋具有抗氧化、抗菌、促進疲勞恢復、調節(jié)血壓和調節(jié)血糖等功能性治療特性[7]。多酚類化合物是食醋的重要特征成分，具有抗氧化活性，對食醋的營養(yǎng)價值和產(chǎn)品品質等指標起著重要作用[8-9]。因此，食醋中總多酚的準確定量，對控制食醋的品質具有十分重要的意義。

多酚類化合物是分子中具有多羥基化合物的總稱，包括黃酮類化合物和酚酸類化合物等[10]。目前，多酚化合物的分析方法主要有高效液相色譜-紫外可見或二極管陣列檢測法[11-12]、毛細管電泳檢測法[13-14]和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法[15-16]等。與其他方法相比，這些儀器分析方法具有更高的準確性和更低的檢測限，但是，這些基于色譜和質譜的分析方法在應用上也有很大的局限性，包括需要繁瑣的樣品預處理過程和復雜的儀器，造成每個樣品的測試成本偏高。目前，紫外可見分光光度法已廣泛應用于多種分析物的定量分析，但由于光譜重疊性強、選擇性低，在多組分溶液分析中仍面臨挑戰(zhàn)。經(jīng)典的實驗室總酚含量測定方法是基于光譜檢測的Folin-Ciocalteu法[17-18]，這是一種方便和簡單的分析總酚含量的技術，在葡萄酒等多種食品中總酚含量的測定中有廣泛應用[19-21]。但是，這些方法在樣品處理、試劑用量、顯色反應條件和實際測量以及對照標準品等方面各不相同，數(shù)據(jù)可比性差。而且，迄今為止，我國也還沒有應用于食醋中總多酚含量測定的統(tǒng)一方法和相關標準。

本試驗采用分光光度法測定食醋中總多酚的含量。Folin-Ciocalteu試劑中的鉬鎢酸鹽氧化多酚化合物中-OH基團并顯藍色，在最大吸收波長760 nm處測定藍色金屬絡合物溶液的吸光度，以沒食子酸作校正標準定量測定食醋中總多酚含量。通過對包括樣品處理、顯色劑用量、顯色條件和測量時間等影響顯色反應的各影響因素進行優(yōu)化，確定了食醋中總多酚的定量分析方法。該方法簡便、準確且檢測成本低、儀器普及率高、適用性強。此外，也比較了市售的中國四大名醋(包括鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、福建永春紅曲醋和四川保寧醋)中總多酚的含量。研究結論為我國食醋中總多酚含量測定的行業(yè)標準的建立提供了理論依據(jù)，為當前我國食醋產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中實現(xiàn)產(chǎn)品品質的快速精準檢測提供了有效的技術手段，有利于現(xiàn)階段食醋產(chǎn)品的質量控制和品質評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸(98%)：成都埃法生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑(相應酸濃度為2 mol/L)：美國Sigma-Aldrich公司；碳酸鈉(分析純)：北京化工廠。所有稀釋液均由美國密理博(Millipore)Milli-Q凈水系統(tǒng)生產(chǎn)的去離子水制備。

鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、福建永春紅曲醋和四川保寧醋：北京超市市售產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津制作所；LAB MX-F渦旋混合器 大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司；CF16RN多用途冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸標準溶液的配制

準確稱取沒食子酸對照品適量于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，搖勻，配制成濃度約為100 μg/mL的沒食子酸標準溶液。

1.3.2 食醋樣品溶液的配制

準確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，加入約40 mL水，于30～35 ℃超聲30 min，在室溫下用水定容至刻度，搖勻備用(也可于8000 r/min離心后取上清液備用)。

1.3.3 檢測波長的確定

準確量取沒食子酸標準溶液、食醋樣品溶液及水各1 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻，靜置3～5 min后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，渦旋混勻，在1～8 min內(nèi)各加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，渦旋混勻，再用水定容至刻度，搖勻。避光放置于30 ℃水浴中2 h，于200～800 nm進行全波長掃描。

沒食子酸標準溶液和食醋樣品溶液全波長掃描圖見圖1。

圖1 沒食子酸標準溶液(A)和食醋樣品溶液(B)全波長掃描圖Fig.1 The scanning spectra of gallic acid standard solution (A) and vinegar sample solution (B)

由圖1可知，沒食子酸標準溶液和食醋樣品溶液在759.1 nm均有一個最大吸收峰，且空白溶液無干擾，故選擇760 nm作為檢測波長。

1.3.4 沒食子酸標準曲線的制備

準確量取1.3.1項下沒食子酸標準溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.0 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，各加入4 mL水，渦旋混勻后按照1.3.3項下方法進行顯色，同時以水為空白樣品進行顯色，于760 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、沒食子酸標準溶液質量濃度為橫坐標進行線性回歸分析。標準溶液的濃度分別為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL。

1.3.5 空白溶液的制備

加入5 mL水于10 mL棕色容量瓶中，按照1.3.3項下方法進行顯色，于760 nm處測定吸光度。

1.3.6 食醋測試樣品的制備

準確量取1.3.2項下食醋樣品溶液1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻后按照1.3.3項下方法進行顯色，于760 nm處測定吸光度。每個樣品做3份平行，結果取平均值。

1.3.7 計算公式

式中：W為食醋中總多酚含量(g/100 g)；c為試驗樣品溶液中多酚組分濃度(μg/mL)；m為食醋樣品的稱樣量(g)；結果保留三位有效數(shù)字。

2 結果與分析

2.1 食醋樣品溶液制備用溶劑的選擇

準確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，平行3份，分別加入約40 mL水、25%乙醇和50%乙醇，于30～35 ℃超聲30 min，室溫下分別用水、25%乙醇和50%乙醇定容至刻度，搖勻后于8000 r/min離心后取上清液備用。準確量取上述食醋樣品溶液1.0 mL，按照1.3.3項下方法顯色后在760 nm處測定吸光度，綜合分析測定結果，確定水作為食醋樣品溶液的制備用溶劑。

2.2 顯色時間的考察

對試驗樣品的分析中，其他操作不變，加入顯色劑并定容后，在0～180 min內(nèi)每隔20 min在760 nm處測定吸光度值，結果表明試驗樣品在顯色120 min后，吸光度值趨于穩(wěn)定，故確定顯色反應時間為2 h，并且在隨后的20 min內(nèi)測定得到的吸光度值非常穩(wěn)定。

2.3 顯色劑用量的考察

對試驗樣品的分析中，其他操作不變，僅改變Folin-Ciocalteu試劑的用量(0.25，0.5，0.75，1.0 mL)，或僅改變20%碳酸鈉溶液的用量(1.0，1.5，2.0，2.5 mL)，同法測定吸光度。比較所得吸光度值后確定0.5 mL的Folin-Ciocalteu試劑和1.5 mL的碳酸鈉溶液為最佳顯色劑用量。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準工作曲線

根據(jù)1.3.4項下的方法，以沒食子酸標準溶液濃度(μg/mL)為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準工作曲線，得到線性回歸方程為Y=0.1148X-0.2087，相關系數(shù)R2=0.9992。結果表明沒食子酸在2.0～10.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗

取1.3.4項下10.0 μg/mL的測試用標準溶液，于760 nm處連續(xù)測定吸光度9次，RSD為0.051%，表明該方法的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗

準確量取1.3.2項下的食醋樣品溶液1.0 mL，按照1.3.3項下方法進行顯色反應2 h，然后于760 nm處每隔5 min測定一次吸光度值。結果顯示：顯色反應完成后，測試樣品在20 min內(nèi)吸光度值的RSD為1.40%，表明樣品吸光度值在20 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 方法的準確性和重復性

以Folin-Ciocalteu法測定總多酚，試驗會受到多種干擾化合物(包括抗壞血酸、糖(果糖和蔗糖)、芳香胺、二氧化硫、有機酸和Fe(II)等)的干擾，這些干擾物質在水溶液中溶解性良好。眾所周知，食醋是以乙酸為主要成分的一種酸味調味料，在我國傳統(tǒng)的食醋中除乙酸外，還含有多種有機酸、氨基酸、碳水化合物、酯類、食鹽和多種微量天然生物活性物質如四甲基吡嗪、黃酮類化合物和酚酸類化合物。目前，我國國家標準GB/T 19777-2013《地理標志產(chǎn)品 山西老陳醋》規(guī)定，山西老陳醋中的總黃酮含量應不低于60 mg/100 g，國家標準GB 2719-2018《食品安全國家標準 食醋》規(guī)定總酸(以乙酸計)應不低于3.5 g/dL。顯然，高含量的乙酸等有機酸的存在可能會干擾總多酚含量的測定。因此，有必要考察乙酸對試驗的影響。

準確稱取乙酸含量為4.3%的白醋樣品0.5000 g于50 mL棕色容量瓶中，按照1.3項下的方法進行白醋樣品溶液的制備和顯色反應，結果顯示：白醋測試樣品的吸光度值與空白樣品的吸光度值一致，這說明白醋樣品確實不含多酚類化合物，同時也證明食醋中的乙酸對Folin-Ciocalteu法測定總多酚含量的干擾可以忽略。

對測定方法的準確性進行了考察。準確稱定6份0.5000 g的食醋樣品于6個50 mL棕色容量瓶中，精密加入1.3.1項下的沒食子酸標準溶液(沒食子酸的加入量為1081 μg)，按照1.3.2食醋樣品溶液配制方法對樣品進行處理，再依據(jù)1.3.3項下顯色條件進行顯色反應并測定吸光度值。食醋樣品加標回收試驗測得的吸光度值和計算的回收率見表1。結果顯示：平均加標回收率為97.2%，相對標準偏差RSD為1.37%，說明該方法的準確性和重復性好，符合食品安全國家標準GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的規(guī)定。

表1 食醋樣品加標回收試驗結果Table 1 The results of spiked recovery test for vinegar samples (n=6)

2.4.5 我國四大名醋樣品中總多酚的含量測定

我國各類食醋無論從釀造工藝的特色、產(chǎn)品的質量還是受消費者歡迎的程度，基本上都是從鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、四川保寧醋和福建永春紅曲醋這4個類型變化和衍生而來的，因此也稱它們?yōu)橹袊拇竺?，是中國傳統(tǒng)釀造食醋的代表。對市售5年陳釀四大名醋中的總多酚含量進行了分析，結果見表2。

表2 中國四大名醋總多酚含量測定結果Table 2 The determination results of total polyphenols＇ content in four Chinese famous vinegar

結果顯示：四大名醋總多酚含量在0.237～0.604 g/100 g的范圍內(nèi)。其中，四川保寧醋的總多酚含量最高，為0.604 g/100 g，福建永春米醋的總多酚含量最低，為0.237 g/100 g。這證明不同工藝、不同品牌的食醋產(chǎn)品總多酚含量不同，而總多酚含量是評價食醋品質的重要指標之一。

3 結論

本試驗對基于Folin-Ciocalteu法測定食醋中總多酚含量的影響因素進行了考察和優(yōu)化。通過對食醋樣品處理條件、顯色反應時間、顯色劑用量和測量時間等因素的考察，確定了食醋中總多酚含量的測定方法為：準確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻，靜置3～5 min后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，渦旋混勻，在1～8 min內(nèi)各加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，渦旋混勻后再用水定容至刻度，搖勻。避光放置于30 ℃水浴中2 h顯色，并在20 min內(nèi)于760 nm處測定吸光度。該方法溶液體系均一，線性良好，準確度和穩(wěn)定性高，精密度和重復好，儀器普及率高且操作方便、簡單，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可比性強，易于推廣，可以應用于食醋產(chǎn)品質量控制和品質評價中總多酚含量的測定。