高敏，陸寧

(1.云南輕紡織職業(yè)學院，昆明 650300；2.安徽農(nóng)業(yè)大學 茶與食品科技學院，合肥 230036)

果膠是一種天然的食品添加劑，具有乳化、增稠和膠凝作用，被廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-2]。同時，果膠也兼具天然的抗輻射功能和養(yǎng)顏護膚功能，目前如何將其應(yīng)用于化妝品加工中成為果膠應(yīng)用領(lǐng)域的熱點問題。天然果膠物質(zhì)廣泛存在于植物的果實與根莖中，通常以原果膠、果膠和果膠酸形態(tài)存在。目前多以干燥的檸檬皮、蘋果皮作為果膠的主要來源，此外，菠蘿皮也富含果膠，可以作為果膠生產(chǎn)的原料[3]。

在食品加工領(lǐng)域，使用果膠添加劑可以對食品的口感、質(zhì)地、形狀和存儲時間進行一定的優(yōu)化。由于其與糖的口感相似且具有脂肪一般的質(zhì)地，因此，多使用其去糖與脂肪，對口感缺失的食品進行口感恢復(fù)。由文獻研究可知，從不同的原料中提取到的果膠，甲酯化程度會出現(xiàn)一定的差異。在果膠使用的過程中由于果膠酯化基團分布的差異性，不同的果膠與食品的結(jié)合效果也有所不同[4]。為了對其在食品中的使用進行更加深入的了解，此次研究將對果膠甲酯酶類添加劑在食品加工中的應(yīng)用進行試驗，以期為果膠甲酯酶類添加劑的使用提供引導(dǎo)與新的方向。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料來源

果膠常在植物體內(nèi)以不溶于水的原果膠形式存在，因此，在研究中需選定部分植物作為果膠提取原料，并結(jié)合合適的化學試劑完成添加劑樣本制備過程。化學試劑選擇結(jié)果及純度見表1。

表1 化學試劑Table 1 The chemical reagents

使用上述選取的試劑與原料，完成果膠甲酯酶類添加劑的制取過程。

1.2 試驗設(shè)備

此次研究中所需設(shè)備見表2，將上述設(shè)備安裝到實驗室中，組成相應(yīng)試驗設(shè)備系統(tǒng)。

表2 主要儀器Table 2 The main instruments

續(xù) 表

1.3 樣本制備

根據(jù)文獻研究結(jié)果及以往試驗環(huán)節(jié)設(shè)定情況，制備流程見圖1。

圖1 果膠甲酯酶類添加劑樣本制備流程Fig.1 The preparation process flow of pectin methylesterase additive samples

1.4 樣本制備工藝要點

原料處理：獲取新鮮果膠原料，使用剪刀將其分割為若干份，滅活酶處理后，將其放置于65 ℃干燥箱內(nèi)進行干燥處理。每15 min翻動一次，完全烘干后使用粉碎機打碎，過篩待用。

果膠提?。捍谁h(huán)節(jié)分為酸提取與酶提取兩部分。將適量的蒸餾水加入粉碎過篩的原料中，攪拌均勻后加入適量的酸，調(diào)節(jié)pH值，在恒溫水浴鍋中酸解，使用濾布過濾酸提取液。在過濾后的提取液中加入適量的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值，加入適量的酶，混合均勻后使用恒溫水浴鍋進行溶液中酶的降解。根據(jù)以往試驗中設(shè)定的反應(yīng)時間，設(shè)計此環(huán)節(jié)的處理時間，并選擇合適的濾布對提取液進行過濾。

果膠沉淀：在過濾后的溶液中滴入適量的乙醇，混合均勻后調(diào)節(jié)pH值。沉淀一段時間后，使用離心機對其進行處理，得到果膠沉淀物。提取沉淀物放置于鼓風干燥箱中烘干到恒重，得到果膠樣本。

在此環(huán)節(jié)中使用的果膠得率公式如下：

(1)

式中：C表示果膠得率，v1表示果膠質(zhì)量，g1表示原料干燥粉末質(zhì)量。

使用電子天平稱取0.5～1.0 g果膠，將其完全溶解至100 mL蒸餾水中，在溶液中滴入酚酞指示劑[5-6]，使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定變色，而后加入5 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，放置于室溫中皂化3 h，使用0.1 mol/L硫酸溶液滴定至褪色，完成樣本甲氧基含量的測定過程，具體甲氧基含量計算公式如下：

(2)

式中：D表示甲氧基含量，h1表示皂化時加入的氫氧化鈉溶液體積，d1表示皂化時加入的氫氧化鈉溶液濃度，h2表示滴定皂化后剩余堿液的硫酸體積，d2表示滴定皂化后剩余堿液的硫酸濃度，m表示測定過程中的果膠質(zhì)量，0.031表示甲氧基的毫摩爾數(shù)。

將配制好的果膠樣本倒入干凈的烏氏粘度計中，保證其刻度線垂直于地面后，將烏氏粘度計放置于35 ℃恒溫水浴鍋中，等待粘度計的刻度線全部浸入溶液中，恒溫處理10 min。使用洗耳球?qū)⑷芤河擅毠芸诖迪拢瑪嚢?。而后，等待溶液自由下落，當測定溶液自由流向兩球之間刻度線時，按下秒表暫停計時。反復(fù)測定3次，取測定結(jié)果平均值作為最后輸出結(jié)果。粘度計控制測定流速在120～200 s最佳。樣本粘度計算公式如下：

P=α×J。

(3)

式中：α表示樣本流經(jīng)時間，J表示粘度計常數(shù)，P表示運動粘度。通過上述計算過程，確定果膠甲酯酶類添加劑的制取條件。

2 試驗方法

2.1 酯化度測定

為保證樣本的酯化程度符合此次研究的需要，使用滴定法測試果膠酯化度。在獲取到的果膠溶液中滴入適量的蒸餾水，將其配制為15 mL 0.1% (W/V)的樣本溶液。在樣本中滴加2～3滴酚酞指示劑，并使用1.0 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至變色，將滴入的氫氧化鈉溶液體積記作A1。隨后，在此溶液中緩慢加入15 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，使用磁力攪拌器攪拌20 min，得到甲酯化果膠。最后，在此溶液中滴入15 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定酚酞指示劑變色，在此環(huán)節(jié)中消耗的氫氧化鈉溶液體記作A2。設(shè)定酯化度為B，則有：

(4)

2.2 果膠酶活力測定

在15 mL的比色管中滴入2.0 mL 2%的樣本溶液，在45 ℃條件下保溫5 min，加入0.5 mL稀釋酶液后開始計數(shù)，在45 ℃環(huán)境下反應(yīng)30 min，滴入3 mL DNS溶液后，終止反應(yīng)。沸水浴10 min，將溶液稀釋至20 mL，取1 mL溶液加入蒸餾水稀釋至5 mL，在550 nm處測定吸光值，對照D-半乳糖醛酸標準曲線[7-8]獲取還原糖含量，計算果膠酶活力。具體果膠酶活力計算公式如下：

(5)

式中：F表示果膠酶活性，n表示反應(yīng)過程中生成的還原糖含量，194.14表示葡萄糖的摩爾質(zhì)量，v表示反應(yīng)溶液體積，t表示反應(yīng)時間，E表示酶液濃度。

2.3 食品pH值對果膠酶使用效果影響測定

稱取10 mL果膠添加劑樣本，使用檸檬酸溶液將其pH值調(diào)節(jié)為3.5，并使用pH值為3.5的緩沖液將其定容至100 mL。分別配制pH值為3.8，4.0，4.2，4.4的食品材料。取12支比色管，每3支一組，分別注入pH 3.8，4.0，4.2，4.4的食品材料3 mL以及果膠酶溶液1 mL,在40 ℃環(huán)境下反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，使用滴管取上清液，利用分光光度計測量其透光度，繪制變化曲線。

2.4 果膠酶處理時間對其使用效果影響測定

取12支比色管，每3支一組，以每支比色管中抽取2.3測定環(huán)節(jié)中得到的最佳pH值食品稀釋液3 mL。加入1 mL相應(yīng)pH值的果膠酶溶液后，在40 ℃環(huán)境中，反應(yīng)15，30，45，60 min反應(yīng)結(jié)束后，使用滴管取上清液，利用分光光度計測量其透光度，繪制變化曲線。

2.5 果膠酶處理溫度對其使用效果影響測定

取12支比色管，每3支一組以每支比色管中抽取2.3測定環(huán)節(jié)中得到的最佳pH值食品稀釋液3 mL。加入1 mL相應(yīng)pH值的果膠酶溶液后，分別放置于30，35，40，45 ℃環(huán)境中反應(yīng)60 min，在每個溫度條件下取3組測定結(jié)果平均值作為最終結(jié)果。使用滴管取上清液，利用分光光度計測量其透光度，繪制變化曲線。

2.6 果膠酶添加量對其使用效果影響測定

取12支比色管，每3支一組并進行編號。以每支比色管中抽取2.3測定環(huán)節(jié)中得到的最佳pH值食品稀釋液3 mL，而后在1～4號中分別加入1 mL蒸餾水、稀釋倍數(shù)3.4，700，14，75.20 U/mL的添加劑溶液。根據(jù)上述兩部分測定結(jié)果，設(shè)定處理時間和溫度，處理后使用滴管取上清液，利用分光光度計測量其透光度，繪制變化曲線。

2.7 數(shù)據(jù)處理

本次研究中所有測定方案均進行3次，并采用SPSS 24.0和Origin 2017軟件[9-10]對數(shù)據(jù)和圖表進行分析，試驗數(shù)據(jù)之間差異使用SPSS 24.0完成計算過程。

3 結(jié)果與分析

3.1 果膠甲酯酶類添加劑基本性能測定結(jié)果分析

通過測定可知，使用滴定法可得到不同果膠的酯化度。由圖2可知，所有果膠的酯化度均在29.00%～72.50%之間，此種添加劑的酯化度符合后續(xù)試驗要求。

圖2 果膠添加劑酯化度測定結(jié)果Fig.2 The determination results of esterification degree of pectin additives

由圖3可知，此次試驗中果膠酶的活性完全符合食品添加劑的使用要求，因此可以使用此次樣品制備中獲取的果膠酶添加劑作為試驗測定的對象，開展后續(xù)的測定環(huán)節(jié)。

圖3 果膠酶活力測定結(jié)果Fig.3 The determination results of pectinase activity

3.2 食品pH值對果膠酶使用效果影響分析

食品樣本的pH值對食品添加劑的使用效果具有一定的影響。同時也會影響添加劑內(nèi)果膠的穩(wěn)定性。通過分析可知，pH值對酶活力的影響主要體現(xiàn)為其對酶的活性條件及空間結(jié)構(gòu)具有破壞性。pH值過高會使酶失去活性，導(dǎo)致添加劑的使用效果下降。由圖4可知，當pH值在3.8～4.2區(qū)間內(nèi)，溶液的澄清度隨著pH值的增加而上升。此區(qū)間后，溶液的澄清度逐漸下降。因此，添加劑使用的pH值最佳取值區(qū)間為3.8～4.2。

圖4 食品pH值對果膠酶使用效果影響測定結(jié)果Fig.4 The determination results of food pH values on pectinase usage

3.3 果膠酶處理時間對其使用效果影響分析

隨著反應(yīng)時間的增加，添加劑與食品樣本完全反應(yīng)后，食品樣本的澄清度不再發(fā)生變化。由圖5可知，在15～60 min內(nèi)，樣本的澄清度隨著時間的增加而變化。45 min后液體的澄清速度逐漸下降，變化綜合考慮，最佳反應(yīng)時間在15～45 min。

圖5 果膠酶處理時間對其使用效果影響測定結(jié)果Fig.5 The determination results of pectinase treatment time on its use effect

3.4 果膠酶處理溫度對其使用效果影響分析

在添加劑的使用過程中，溫度與時間對其使用效果具有密切的關(guān)系。由于添加劑中酶蛋白的變性隨時間變化而改變，因此，在溫度變化初始階段，酶蛋白的變性尚未顯示出來。隨著溫度的逐漸提升，其反應(yīng)活性逐漸下降。由圖6可知，添加劑在溫度的變化中，其曲線趨勢呈現(xiàn)“凸”形。對圖像進行分析可以看出，當溫度在35～40 ℃時，添加劑活性最佳。當溫度過高時，添加劑中的酶蛋白活性逐漸喪失，導(dǎo)致食品樣本中的固體物含量逐漸增加。

圖6 果膠酶處理溫度對其使用效果影響測定結(jié)果Fig.6 The determination results of pectinase treatment temperature on its use effect

3.5 果膠酶添加量對其使用效果影響分析

在食品添加劑與食品樣本作用過程中，當樣本濃度大于食品添加劑濃度時，添加劑被食品樣本飽和，其反應(yīng)作用會隨著添加劑酶濃度的增加而增加。由圖7可知，添加劑的使用效果隨著果膠酶濃度的增加而增加。當添加劑酶濃度為14～700 U/mL時，食品樣本溶液的透光性逐漸提升。綜合上述分析可以看出，食品添加劑酶濃度最佳區(qū)間為14～700 U/mL。

圖7 果膠酶添加量對其使用效果影響測定結(jié)果Fig.7 The determination results of pectinase additive amount on its use effect

3.6 果膠甲酯酶類添加劑加工工藝正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)以上果膠甲酯酶類添加劑單因素應(yīng)用試驗結(jié)果進行正交試驗，以此確定果膠甲酯酶類添加劑在食品加工中的最佳使用方案，見表3。

表3 果膠甲酯酶類添加劑用量水平表Table 3 The additive amount of pectin methylesterase additive

根據(jù)以上設(shè)定得到復(fù)合飲料配方正交試驗結(jié)果,見表4。

表4 果膠甲酯酶類添加劑正交試驗結(jié)果Table 4 The orthogonal test results of pectin methylesterase additive

續(xù) 表

由表4可知，影響食品添加劑使用效果影響順序為A>B>D>C，即添加劑用量>作用時間>pH值>溫度。同時確定其最佳配比為A3B3C2D2，即添加劑酶用量為75.20 U/mL，反應(yīng)時間為45 min，反應(yīng)溫度為38 ℃，食品pH值為4.0。

使用上述方案得到樣本的透光率為88.0%，證明此方案的使用效果最佳。將此方案應(yīng)用于食品加工中可有效提升食品加工效果。

4 結(jié)論

此次研究以果膠甲酯酶類添加劑作為研究對象，研究其制取過程以及在食品加工過程中的應(yīng)用效果。選擇食品樣本pH值、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和酶添加量作為單因素試驗和正交試驗的測定對象，由此得出果膠甲酯酶類添加劑最佳制備工藝及使用條件。由多輪試驗結(jié)果可知，果膠甲酯酶類添加劑最佳使用工藝為添加劑酶用量為75.20 U/mL，反應(yīng)時間為45 min，反應(yīng)溫度為38 ℃，食品pH值為4.0。將此研究結(jié)果作為添加劑的使用方式，可擴大果膠甲酯酶類添加劑在食品加工中的應(yīng)用范圍，提升食品添加劑領(lǐng)域的研究深度。