邢蕊，胡宗武，梁笑天，董蔚，漆倩涯

(1.蘭州中檢科測試技術(shù)有限公司，蘭州 730070；2.蘭州理工大學(xué) 石油化工學(xué)院，蘭州 730050)

醬菜是將新鮮的蔬菜經(jīng)腌漬、微生物發(fā)酵或醬漬加工而成的各種蔬菜制品[1]，因味道鮮美、營養(yǎng)豐富而深受人們的喜愛，逐漸成為人們飯桌上不可或缺的調(diào)味副食品[2-3]。脫氫乙酸是一種低毒高效的食品防腐劑[4-5]，常用于面包、糕點、果蔬汁、發(fā)酵豆制品、腌漬的蔬菜等食品中[6]。但是大量地使用脫氫乙酸將會影響人體的腎臟、肝臟[7]，甚至可能引發(fā)癌癥[8]，同時GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[9]中也明確指出了脫氫乙酸在一些食品中的最大使用量，其中在腌漬的蔬菜中脫氫乙酸的最大使用量為1.0 g/kg[10]。因此，我們對食品中脫氫乙酸的使用進行日常監(jiān)管及對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性判斷顯得尤為重要[11]。

本實驗依據(jù)GB 5009.121-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》[12]、JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[13]和CNAS-GL006-2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[14]中規(guī)定的基本方法和程序，采用高效液相色譜法對醬菜中脫氫乙酸的含量進行了測定，分析醬菜中脫氫乙酸含量的不確定度來源，并對其測定結(jié)果的不確定度進行了計算和評定，從而為醬菜中脫氫乙酸含量測定方法的可行性和準(zhǔn)確性提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬菜：市售；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：批號B0003452，純度99.9%，北京曼哈格生物科技有限公司；乙酸銨：色譜純，Aladdin公司；甲醇：色譜純：HiPure Chem公司；硫酸鋅和氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器) 日本島津公司；ME204E電子天平 梅特勒-托利多公司；KQ-500DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；LD5-2B離心機 北京雷勃爾離心機有限公司。

1.3 實驗方法

參照GB 5009.121-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》第二法液相色譜法。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用1 mL氫氧化鈉溶液(20 g/L)溶解在10 mL容量瓶中，用水定容，配制成1000 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別吸取脫氫乙酸貯備液0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mL于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱取已粉碎的試樣2 g，置于50 mL離心管中，加入約10 mL水、5 mL硫酸鋅溶液(120 g/L)，用氫氧化鈉溶液(20 g/L)調(diào)pH至7.5，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。置于離心管中，超聲提取10 min，4000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱 ZORBAX Eclipse Plus C18柱 (4.6 mm×250 mm×5.0 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇+0.02 mol/L乙酸銨溶液(10+90，體積比)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：293 nm。

1.4 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中脫氫乙酸含量的計算公式為：

式中：X為樣品中脫氫乙酸的含量，g/kg；C為樣品溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；C0為空白樣品溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品溶液總體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)實驗方法所建立的數(shù)學(xué)模型并結(jié)合相關(guān)信息，分析影響測定結(jié)果的不確定度，其主要來源于樣品的稱量、樣品溶液的定容、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、容量瓶的校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、樣品的重復(fù)性分析等過程。

通過分析以上各不確定度分量，并合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。在95%的置信水平下，得到擴展不確定度，最終量化高效液相色譜法測定醬菜中脫氫乙酸含量的不確定度。

2.2 不確定度各分量的評定

2.2.1 樣品稱量過程中引入的不確定度

稱量過程的重復(fù)性和天平的準(zhǔn)確性是樣品稱量過程中不確定度的主要來源，其中樣品稱量過程中的重復(fù)性所引入的不確定度分量已包含在各種因素造成的重復(fù)性影響修正值不確定度分量中。

根據(jù)電子天平的檢定證書，天平的分辨率為0.1 mg，稱樣量m≤50 g時，最大允許誤差為±0.5 mg，稱取樣品2 g，按均勻分布，則不確定度為：

則稱重的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品定容過程中引入的不確定度

樣品定容過程中的不確定度主要是容量瓶的準(zhǔn)確性和溫度變化兩個方面引入的。

2.2.2.1 容量瓶的準(zhǔn)確性引入的不確定度

經(jīng)計量校準(zhǔn)，本次實驗所用的25 mL容量瓶合格，根據(jù)校準(zhǔn)證書可得其容量的允許誤差為±0.03 mL，按均勻分布，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2.2 溫度變化引入的不確定度

玻璃器具出廠校準(zhǔn)溫度與實驗室使用溫度的差異是溫度變化引入的不確定度，已知玻璃器具的校準(zhǔn)溫度為20 ℃，本實驗室實際使用溫度變化范圍為±3 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，則不確定度分量為：

2.2.2.3 定容過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.3 由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得結(jié)果引入的不確定度

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程和擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線非線性所引入的不確定度是標(biāo)準(zhǔn)曲線求得結(jié)果引入的不確定度主要來源。

2.2.3.1 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，本實驗所用的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.9%，其相對擴展不確定度為2%，k=2，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

由本實驗所用電子天平的檢定證書可知，天平的分辨率為0.01 mg，稱樣量m≤5 g時，最大允許誤差為±0.05 mg，稱取標(biāo)品9.68 mg，按均勻分布，則不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中所用容量瓶準(zhǔn)確性引入的不確定度

本實驗采用10 mL A級容量瓶配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，其允許誤差為±0.020 mL，假設(shè)為均勻分布，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度變化引入的不確定度

水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，本實驗室使用溫度與校準(zhǔn)溫度變化范圍為±3 ℃，則不確定度分量為：

2.2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度

本實驗采用6個濃度水平點的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度點測定2次，測定結(jié)果見表1。

表1 脫氫乙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果Table 1 The determination results of standard curves of dehydroacetic acid

本實驗對樣品測定液進行了6次測定，由直線方程求得各次測量值，計算其平均質(zhì)量濃度為C=9.834 μg/mL，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

將以上各計算值帶入公式，得標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度：

=0.00788。

即得由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得結(jié)果引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.0131。

2.2.4 各種因素造成的重復(fù)性引入的不確定度

在整個處理過程中，因樣品前處理的不確定度有溫度、時間、加入試劑的量、提取效率、容器附著的量等引入的不確定度分量，可通過平行測定來評估不確定度分量。

在重復(fù)性條件下，對樣品進行了6次獨立測試，脫氫乙酸含量分別是0.122，0.123，0.123，0.121，0.122，0.123 g/kg，則脫氫乙酸含量的平均值為0.122 g/kg，則樣品測試的重復(fù)性所引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成及擴展

2.3.1 各不確定度分量匯總

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見表2。

表2 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表Table 2 The relative standard uncertainty components

2.3.2 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

對上述各不確定度分量進行分析，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.0135。

2.3.3 相對擴展不確定度

取置信概率95%，k=2，得高效液相色譜法測定醬菜中脫氫乙酸的相對擴展不確定度為：

Urel=k×Urel(y)=2×0.0135=0.0270。

2.3.4 擴展不確定度

由實驗數(shù)據(jù)可知樣品中脫氫乙酸含量為0.122 g/kg，其擴展不確定度為：

U=0.122×0.0270=0.003 g/kg。

2.3.5 結(jié)果表示

通過高效液相色譜法測定醬菜中脫氫乙酸含量，測定結(jié)果為：

X=(0.122±0.003) g/kg，k=2。

3 結(jié)論

參照GB 5009.121-2016中的方法，采用高效液相色譜法對醬菜中脫氫乙酸的含量進行了測定，并根據(jù)JJF 1059.1-2012和CNAS-GL006-2019中規(guī)定的方法和程序，對實驗過程中影響脫氫乙酸含量的各不確定度進行分析和評定。通過分析發(fā)現(xiàn)，對測定結(jié)果影響最大的是由標(biāo)準(zhǔn)曲線所求得的濃度，其次是測定的重復(fù)性。而樣品稱量和樣液定容所引入的不確定度較小。因此，在實驗過程中我們應(yīng)選擇質(zhì)量穩(wěn)定、準(zhǔn)確度等級較高的標(biāo)準(zhǔn)品，嚴格把控標(biāo)準(zhǔn)品的配制過程，其次可增加標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度點和測定次數(shù)，加強操作人員的培訓(xùn)，檢測儀器的校準(zhǔn)等措施減小測定結(jié)果的不確定度，從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。