葛 亮，向悅?cè)A，譚 旎

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 恩施 445000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)主要特征表現(xiàn)為肺血管收縮增強和肺血管結(jié)構(gòu)重建，低氧會造成PAH壓力持續(xù)存在，是肺血管重建病理基礎(chǔ)[1]，因此緩解血管重構(gòu)對于PAH至關(guān)重要。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)在抗氧化中發(fā)揮重要作用，活化Nrf2可上調(diào)下游靶標，發(fā)揮抗氧化作用，改善內(nèi)皮細胞紊亂，參與血管重構(gòu)過程[2]。Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號通路可調(diào)控下游靶基因磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1(NADPH quinineoxidoreductase-1，NQO-1)、血紅素氧合酶1(heme oxygenase1，HO1)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和實現(xiàn)對細胞的保護作用[3]。推測Nrf2激活可能通過影響上述通路實現(xiàn)對PAH的保護。因此，低氧誘導(dǎo)建立PAH大鼠模型，觀察Nrf2激動劑萊菔硫烷(sulforaphane，SFP)對PAH大鼠的影響并初步探討其作用機制，以期為臨床治療PAH提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：雄性SPF級大鼠，體質(zhì)量180～220 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2017-0013]。飼養(yǎng)條件：光照/黑暗(12 h/12 h)、溫度(23±1)℃、濕度(55±5)%，自由飲水飲食。本研究經(jīng)恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院動物倫理委員會審核并批準(文號：2019000412)。

1.1.2 試劑：SFP(TRC公司)；HE試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物岐化酶(SOD)檢測試劑盒、胞質(zhì)和核蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；一抗兔抗Nrf2、NQO1、HO1(Abcam公司)；一抗兔抗ARE(Santa Cruz公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2、MMP-9引物(由上海生工生物工程股份有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組：將大鼠分為對照組、低氧組、Nrf2激活組，每組8只。Nrf2激活組低氧處理前一周每天灌胃5 mg/kg SFP，連續(xù)4周，低氧處理：低氧大鼠飼養(yǎng)艙灌入氮氣，維持氧濃度于10%±0.5%，每天8 h，每周6天，共3周復(fù)制PAH模型。

1.2.2 心肺血流動力學(xué)和右心室肥大指標的檢測：檢測大鼠平均肺動脈壓力(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)，剪下右心室(right ventricular，RV)，稱量RV和左心室(left ventricular，LV)+室間隔(interventricular septum，S)的重量，計算右心室肥厚指數(shù)=RV/(LV+S)。實驗結(jié)束后立即將肺動脈組織部分置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋后切片。部分置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 HE染色檢測肺血管重構(gòu)：光學(xué)顯微鏡下利用血管圖像分析儀，每只大鼠測定6條肺小動脈血管壁面積(wall area，WA)、血管總面積(total vaseular area，TA)、血管中膜厚度(mesothelium thickness，MT)及血管動脈外徑(external diameter of blood tubular artery，ED)，計算WA/TA、相對血管中膜厚度(MT/ED)。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標MDA水平、SOD活性的檢測：按照試劑盒說明書檢測肺動脈組織中MDA(硫代巴比妥酸法)水平、SOD(氮藍四唑法)活性。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測肺動脈中MMP-2、MMP-9 mRNA水平：RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，MMP-2 上游引物：5′-TGTAAACAACTTTTGGACACATCTGGG-3′，下游引物：5′-AAATAGGTGACACGTGAAAAGTGCCTT GCA-3′；MMP-9 上游引物：5′-AGACACCTCTGCCCT CACCATGA-3′，下游引物：5′-AAGGTTAGAGAATCC AAGTTTATTAGAAACACTCC-3′；GADPH上游引物：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物：5′-TT GCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL、2×Mix 10 μL、F/R各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、61 ℃退火80 s，45個循環(huán)。2-ΔΔCt法分析各組MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達水平。

1.2.6 Western blot檢測肺動脈組織中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平：參照胞質(zhì)和核蛋白提取試劑盒說明，分離細胞核和細胞漿，檢測Nrf2蛋白水平。蛋白裂解液裂解提取肺動脈總蛋白，檢測ARE、NQO1、HO1蛋白水平。凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉，對應(yīng)加入一抗Nrf2、ARE、NQO1、HO1、GAPDH、Lamin B1，4 ℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Nrf2激活對大鼠心肺血流動力學(xué)和右心室肥大指標的影響

與對照組相比，低氧組mPAP、RV/(LV+S)水平升高(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組mPAP、RV/(LV+S)水平降低(P<0.05)(表1)。

表1 3組大鼠mPAP、RV/(LV+S)水平比較Table 1 Comparison of mPAP and RV/(LV+S)levels of rats in three

2.2 Nrf2激活對大鼠肺血管重構(gòu)的影響

與對照組相比，低氧組WA/TA、MT/ED升高(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組WA/TA、MT/ED降低(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 3組大鼠肺動脈HE染色情況Fig 1 HE staining of pulmonary artery in 3 groups (scale bar=100 μm)

表2 3組大鼠WA/TA、MT/ED比較Table 2 Comparison of WA/TA and MT/ED in 3

2.3 Nrf2激活對大鼠肺動脈組織中MDA水平、SOD活性的影響

與對照組相比，低氧組肺動脈組織中MDA水平升高(P<0.05)、SOD活性降低(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組肺動脈組織中MDA水平降低(P<0.05)、SOD活性升高(P<0.05)(表3)。

表3 3組大鼠肺動脈組織中MDA水平、SOD活性比較Table 3 Comparison of MDA level and SOD activity in pulmonary artery tissues of three groups of

2.4 Nrf2激活對大鼠肺動脈組織中MMP-2、MMP-9 mRNA水平的影響

與對照組相比，低氧組肺動脈組織中MMP-2、MMP-9 mRNA水平升高(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組肺動脈組織中MMP-2、MMP-9 mRNA水平降低(P<0.05)(表4)。

表4 3組大鼠肺動脈組織中MMP-2、MMP-9mRNA水平比較Table 4 Comparison of mRNA levels of MMP-2 and MMP-9 in pulmonary artery of rats in 3 groups

2.5 Nrf2激活對大鼠肺動脈組織中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平的影響

與對照組相比，低氧組肺動脈組織中胞核Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平升高(P<0.05)，胞質(zhì)Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)；與低氧組相比，Nrf2激活組肺動脈組織中胞核Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平升高(P<0.05)，胞質(zhì)Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)(圖2，表5)。

圖2 3組大鼠肺動脈組織中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平Fig 2 Protein levels of Nrf2,ARE,NQO1 and HO1 in pulmonary artery tissue of rats in 3 group

表5 3組大鼠肺動脈組織中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平比較Table 5 Comparison of Nrf2,ARE,NQO1,HO1 protein levels in pulmonary artery of rats in 3 8)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，改善肺血管阻力和肺動脈順應(yīng)性，可以減緩血管重構(gòu)，亦是目前治療PAH的主要方法[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧組mPAP升高，低氧環(huán)境大鼠發(fā)生PAH。右心室肥厚指數(shù)RV/(LV+S)、WA/TA、MT/ED升高，低氧環(huán)境較常氧大鼠血管重構(gòu)形成。

PAH肺血管組織內(nèi)氧自由基生成過多，進而促使肺血管內(nèi)皮細胞損傷，造成內(nèi)皮血管屏障功能喪失，且MDA、SOD共同作用于肺動脈平滑肌細胞，誘導(dǎo)平滑肌細胞增殖增加、凋亡減少，導(dǎo)致血管壁增厚[5-6]。提示PAH肺動脈組織中氧化應(yīng)激水平升高，組織中清除自由基能力降低，過氧化程度加重，機體氧化應(yīng)激嚴重，肺動脈組織損傷嚴重。低氧刺激肺動脈平滑肌細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，由收縮型變?yōu)楹铣杀硇涂煞置贛MP-2、MMP-9能力，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)形成[7]。提示PAH中MMP-2、MMP-9水平升高，平滑肌細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換導(dǎo)致肺血管重構(gòu)形成。

Nrf2作為內(nèi)源性抗氧化途徑中樞轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控抗氧化因子表達[8]?？寡趸委熆杉せ頝rf2通過抑制內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化從而抑制肺血管重構(gòu)，實現(xiàn)對PAH的保護[9]。Nrf2/ARE信號通路直接影響細胞氧化應(yīng)激水平，Nrf2轉(zhuǎn)位進入細胞核，形成異二聚體可與ARE結(jié)合，同時可招募輔助轉(zhuǎn)錄因子，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)抗氧化應(yīng)激、抗炎損傷、抗細胞凋亡等多種功能，從而維持細胞環(huán)境相對穩(wěn)定[10]。NQO1、HO1作為Nrf2/ARE信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子，是抗氧化應(yīng)激蛋白，具有抗氧化損傷作用[11]。PAH狀態(tài)下發(fā)生氧化應(yīng)激，刺激Nrf2核轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)對PAH的保護，但該保護水平有限，最終結(jié)果仍然加重PAH進程。激活Nrf2促進Nrf2入核，Nrf2入核后與ARE結(jié)合，招募NQO1、HO1實現(xiàn)抗氧化，同時減緩平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化，減少血管重構(gòu)，實現(xiàn)對PAH的保護。

綜上所述，Nrf2激活可抑制PAH肺動脈血管重構(gòu)，可能是通過實現(xiàn)抗氧化途徑實現(xiàn)的。但影響血管重構(gòu)途徑較多，Nrf2亦可能通過別的相關(guān)途徑抑制血管重構(gòu)，也是本研究接下來的研究重點。