王夢伊，李倩竹，張世武，舒 鳳，張偉華

(哈爾濱醫(yī)科大學 病理生理學教研室，黑龍江 哈爾濱 150080)

線粒體是大多數(shù)真核細胞有氧呼吸的主要場所，負責為機體生命活動提供ATP，也參與維持離子平衡、傳遞信號、調節(jié)氧化應激和調控細胞凋亡。線粒體雙層膜上有負責運輸線粒體蛋白的轉運系統(tǒng)，以保證其與胞質間的物質交換和信號傳遞。線粒體自身存在蛋白質量控制機制，可以監(jiān)測線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)。線粒體轉運障礙會引起一系列應激反應，激活線粒體降解途徑來恢復線粒體功能。線粒體功能障礙是代謝性疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生機制之一。近年來，很多研究表明糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者發(fā)生心力衰竭的主要原因。因此，研究糖尿病患者的心肌線粒體病變具有重要意義。

1 線粒體轉運系統(tǒng)

哺乳動物線粒體中，13種參與氧化磷酸化的核心蛋白由線粒體基因(mtDNA)編碼，另外1 000多種蛋白由核基因編碼，這些蛋白在胞質合成前體，再進入線粒體進行加工整合。

1.1 轉位酶復合物

TOM(translocase of the outer mitochondrial membrane)復合物是90%以上前體的入口，它由7種亞基構成：Tom5、Tom6、Tom7、Tom20、Tom22、Tom40和Tom70。核心通道Tom40是一個跨外膜的β-桶狀蛋白。Tom20和Tom22可以識別前體N端的基質定位信號(matrix-targeting signals，MTSs)。含有MTS樣信號(internal MTS-like signals，iMTS-Ls)的線粒體蛋白Atp1進入線粒體需要Tom70的存在，證明了Tom70主要識別iMTS-L[1]。Tom5和Tom6參與各亞基間的功能性連接，Tom7則與復合物的解離有關[2]。外膜SAM(sorting and assembly machinery)復合物由Sam35、Sam37、Sam50和輔因子Mdm10組成，負責整合外膜β-桶狀蛋白。β-桶狀蛋白參與線粒體和胞質的物質交換，Sam35(在哺乳動物中為metaxin2)特異性識別其C端的反向平行鏈。Sam37(在哺乳動物中為metaxin1)穩(wěn)定復合物的結構，還參與β-桶狀蛋白的釋放。Sam50是通道蛋白，Mdm10參與TOM復合物的組裝。外膜MIM(mitochondrial import machinery)復合物是一種陽離子門控通道，負責整合含α跨膜信號的外膜蛋白。在酵母菌中，Tom70識別到的前體經MIM復合物插入外膜，而與SAM復合物結合的MIM還能促進TOM復合物的早期裝配過程[3]。

內膜TIM23(translocase of the inner mitochondrial membrane)和PAM(presequence translocase-associa-ted motor)復合物介導大部分基質蛋白和內膜蛋白的轉運。TIM23復合物由Tim17、Tim21、Tim23和Tim50組成。Tim23是復合物的中心通道，與其結合的Tim17參與介導TIM23-PAM復合物的連接。最近的一項研究總結了Tim50的作用：識別前體蛋白的前導序列，并促進其轉移至Tim23通道中[4]。Tim21與Tom40和Tom22結合，連接TIM23-TOM復合物。PAM復合物主要包括Pam16/Tim16、Pam17、Pam18/Tim14、Tim44和mtHsp70。核心成分mtHsp70水解ATP供能，促進底物在Tim23通道中移動，其輔因子Pam18/Tim14和Pam16/Tim16調控ATP的水解與再生。Tim44維持PAM復合物的結構穩(wěn)定，介導TIM23-PAM復合物相互作用，Pam17促進前導序列穿過內膜，Tim44幫助加工后的蛋白導入基質。TIM22復合物由Tim18、Tim22、Tim54和Sdh3組成，負責整合內膜載體蛋白。Tim22是復合物的核心通道，其缺乏會導致TIM22復合物失去結構穩(wěn)定性[5]。Tim54與周圍的小Tim分子作用。呼吸復合物Ⅱ的亞基Sdh3也可以與Tim22相連，參與TIM22復合物的組裝[6]。膜間隙的小TIM復合物主要由Tim8、Tim9、Tim10、Tim12和Tim13組成，最近的一項研究揭示了其三維結構特點[7]：Tim9-Tim10和Tim8-Tim13分別形成六聚體，可以特異性結合不同前體并使其保持易運輸?shù)纳扉L狀態(tài)。Tim12對內膜的親和力較強，可以促進Tim9-Tim10靠近TIM22復合物。

1.2 前體蛋白的運輸途徑

60%的線粒體蛋白經前導序列途徑進入線粒體，Tom20和Tom22負責識別此類蛋白N端帶正電的MTS(前導序列)，前體通過Tom40通道后再由Tim50引導通過TIM23復合物，然后在mtHsp70的作用下單向運動進入基質。線粒體加工肽酶(mitochondrial processing peptidase，MPP)切除前導序列后，在其他肽酶進一步的作用下，前體蛋白最終轉變?yōu)槌墒煨问健３聊畔⒄{節(jié)因子SIR2(silent information regulator 2)家族的Sirt3是一種由核基因編碼的線粒體去乙?；?，可以通過調節(jié)線粒體蛋白的乙?；絹碚{控線粒體的生理活動。Ⅱ型糖尿病小鼠心肌細胞線粒體中Sirt3的水平明顯下降，多種代謝關鍵酶處于高度乙?；癄顟B(tài)，導致線粒體能量代謝紊亂[8]。Sirt3含有MTS，通過前導序列途徑進入線粒體。因此，檢測糖尿病心肌線粒體中TOM復合物或TIM23復合物各亞基的含量和活性可能有助于明確Sirt3減少的分子機制。

在MTS后含有疏水分選信號的內膜蛋白經過TIM23復合物，再由小疏水蛋白Mgr2介導側向釋放到內膜；已進入基質的內膜蛋白(如Tim18)由內膜蛋白Oxa1(oxidase assembly)介導整合。Tom70識別含iMTS-L的內膜載體蛋白，然后蛋白經Tom40跨越外膜，在小TIM復合物的幫助下經TIM22橫向整合到內膜。外膜β-桶狀蛋白(如Tom40)先經Tom40進入膜間隙與小TIM復合物作用，然后經SAM復合物整合到外膜。外膜α-螺旋蛋白(如Tom20)由Tom70識別后經MIM直接插入外膜。膜間隙蛋白(如Tim12)多含特征性半胱氨酸序列，經Tom40進入膜間隙。

線粒體蛋白的導入途徑復雜且靈活，各轉位酶可以重新組合成新的通路發(fā)揮作用，不同物種之間、同一物種不同組織之間，復合物的成分也有所改變。更多元的轉運途徑及其分子機制還有待進一步研究。

2 線粒體降解系統(tǒng)

線粒體降解系統(tǒng)能在蛋白發(fā)生異常折疊、錯誤定位或結構損傷時維持蛋白穩(wěn)態(tài)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)在線粒體質量控制中起重要作用。泛素蛋白是UPS的降解標簽，其與底物的共價結合需要3種泛素酶催化：E1激活酶活化泛素，驅動其轉移至E2結合酶處，E3連接酶催化泛素與底物連接。第一個泛素與底物結合后，后續(xù)的泛素與其賴氨酸殘基相連，形成結構不同的泛素鏈。泛素化蛋白的降解主要由26S蛋白酶體完成，這種蛋白酶體包含兩種亞基：19S識別并結合泛素化蛋白，引導其進入20S通道進行水解。

2.1 線粒體蛋白的降解

在線蟲中，線粒體未折疊蛋白應答(mitochon-drial unfolded protein response，mtUPR)由轉錄因子Atfs-1(activating transcription factor associated with stress-1)介導。Atfs-1含有線粒體定位序列和核定位序列，正常情況下，線粒體基質蛋白酶會迅速降解進入線粒體的Atfs-1。蛋白過度積累時，Atfs-1進入胞核，上調保護性分子伴侶和蛋白酶的表達，通過促進蛋白導入和折疊、增強UPS活性以及增加ATP的單獨產生來恢復線粒體功能；Atfs-1還會下調三羧酸循環(huán)途徑和氧化磷酸化途徑的酶來減少轉錄產物的積累。受損蛋白通過影響Atfs-1的定位來充當激活mtUPR的信號[9]，可見mtUPR能通過調節(jié)多種代謝途徑來保護線粒蛋白穩(wěn)態(tài)和正常功能。酵母菌線粒體蛋白的導入減慢或過度積累會導致蛋白質合成抑制和蛋白酶體活性增強，這一過程稱為錯誤定位蛋白應答(unfolded protein response activated by mistargeting of proteins，UPRam)[10]。在低等真核生物中，mtUPR和UPRam可能同時發(fā)生，也可能存在還未發(fā)現(xiàn)的特異性底物識別能力。哺乳動物的蛋白應激反應更復雜，mtUPR途徑中核基因表達的調控機制和關鍵蛋白還有待進一步研究。

線粒體相關降解(mitochondria-associated degradation，MAD)主要清除聚集在線粒體表面的蛋白。結合在酵母菌TOM復合物的降解蛋白Ubx2在外膜出現(xiàn)蛋白聚集體時招募ATP酶Cdc48/VCP，后者捕獲聚集體并交由蛋白酶體降解[11]。Ufd3(ubiquitin-fusion degradation protein 3)/Doa1和Vms1(VCP-associated mitochondrial stress-responsive 1)是Cdc48發(fā)揮作用所需的輔因子[12]。此外，外膜蛋白Msp1 (mitochondrial sorting of proteins 1)可以作為Cdc48的提取酶，負責清除來自其他細胞器的錯定位蛋白[13]。

受損蛋白應答(mitochondrial compromised pro-tein import response，mitoCPR)是在酵母菌中新發(fā)現(xiàn)的質量控制機制，積累的受損蛋白激活轉錄因子Pdr3(pleiotropic drug-resistant 3)，上調轉位酶相關蛋白Cis1，促進Msp1移除受損蛋白。mitoCPR途徑還能保護mtDNA、恢復氧化還原電位并促進脂質代謝[14]。哺乳動物中尚未發(fā)現(xiàn)mitoCPR，其分子機制也有待進一步研究。

2.2 線粒體蛋白酶

線粒體內的蛋白酶既負責降解受損蛋白，也參與正常生理條件下蛋白質的加工和更新。Lon/Pim1(proteolysis in mitochondria 1)和ClpP(caseinolytic protease proteolytic subunit)是線粒體基質中參與蛋白質量控制的主要蛋白酶。Lon的底物是輕度氧化損傷的蛋白，如烏頭酸酶、轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)等[15]。小鼠體內ClpP缺乏引起的代償反應能預防飲食誘導的肥胖和胰島素抵抗[16]。m-AAA(matrix AAA prote-ase)和i-AAA(intermembrane space AAA protease)位于內膜，分別降解基質和膜間隙的受損蛋白。哺乳動物線粒體內膜的Parl(presenilin associated rhomboid-like protein)蛋白酶參與Pgam5(phosphoglycerate mutase 5)等蛋白的更新[17]。凋亡相關蛋白酶HtrA2存在于膜間隙，HtrA2基因敲除鼠表現(xiàn)為線粒體ATP減少、ATP合成酶缺陷和膜電位下降，說明HtrA2可能參與ATP合成酶成分的翻譯后修飾[18]。

3 線粒體功能障礙與糖尿病心肌病

3.1 線粒體自噬

線粒體嚴重受損時會觸發(fā)自噬，哺乳動物中存在調控自噬的多條途徑。急性應激誘導的線粒體自噬由Pink1(PTEN induced putative kinase 1)和E3連接酶Parkin介導。正常情況下，線粒體蛋白酶會立即降解進入線粒體的Pink1。線粒體去極化時，Pink1在外膜積累，招募并活化Parkin啟動自噬。缺乏Tom40會影響Pink1在線粒體的定位，降低線粒體自噬的效率，說明轉運系統(tǒng)的缺陷不僅阻礙前體轉入，也會影響質量控制機制[19]。哺乳動物的自噬受體Fundc1特異性調節(jié)低氧引起的自噬。正常情況下，磷酸化的Fundc1穩(wěn)定存在于線粒體外膜上，而低氧時，線粒體表面的Pgam5去磷酸化Fundc1而激活自噬。同時，外膜E3連接酶March5促進Fundc1泛素化降解，通過抑制線粒體自噬來增加低氧時的能量供應。Fundc1基因敲除鼠在高脂喂養(yǎng)時表現(xiàn)出更嚴重的肥胖和胰島素抵抗，其白色脂肪組織的線粒體質量控制機制受損[20]。線粒體各降解途徑共同維持線粒體和胞質的蛋白穩(wěn)態(tài)，未來的研究重點仍在于揭示這些途徑的分子機制。

3.2 糖尿病心肌病

糖尿病心肌病(DCM)是除冠心病、高血壓、先天性心臟病等已知心臟疾病之外，由糖尿病引起的心室收縮和舒張障礙，而心力衰竭是DCM嚴重的并發(fā)癥[21]。Ⅱ型糖尿病小鼠的心肌線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增多，氧化呼吸鏈復合物(如復合物Ⅰ、復合物Ⅲ和ATP合酶)酶活性減弱，ATP合成減少。此外，線粒體自噬標志物LC3Ⅱ(light chain 3 Ⅱ)減少，表明DCM患者心肌線粒體的電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)活性降低，ROS生成增多，ATP產生減少，線粒體自噬能力下降。能量不足會降低轉運效率，引起前體積累和蛋白錯折疊，激活mtUPR；蛋白聚集體可能在轉位酶上積累，激活MAD。線粒體內ROS增多會激活Lon-ClpP途徑，通過降解呼吸復合物減少ROS的產生[15]。ETC功能障礙引起的線粒體去極化導致自噬，缺乏Parkin的糖尿病小鼠心肌線粒體自噬受到抑制，并伴有脂質蓄積和DCM加重，而激活線粒體自噬則可以預防高脂飲食誘導的DCM[22]。

Hsp60上調可以看作低等生物發(fā)生mtUPR的標志，而Ⅱ型糖尿病小鼠細胞中Hsp60含量下降[24]。這可能是DCM中mtUPR途徑受阻而導致受損蛋白過度積累的原因。糖尿病心肌線粒體的ETC復合物成分缺失導致其活性受到抑制，ATP產生減少。缺乏能量既可以通過影響心肌線粒體的蛋白平衡間接損傷心肌，也可以直接降低心臟舒張和收縮能力，造成心力衰竭。此外，ROS增多也會降低UPS的效率。環(huán)境改變或線粒體缺陷引起的急性氧化應激使蛋白酶體26S解離，導致有待降解的蛋白積累。這種蛋白酶體分解是可逆的，去除應激源或給予抗氧化劑可以改善泛素化蛋白的更新效率，最近的一項研究進一步確定了線粒體代謝與泛素依賴性蛋白質穩(wěn)態(tài)之間存在密切關系[25]。相比之下，長期暴露在高ROS和高糖高脂環(huán)境中造成的UPS失活更容易導致線粒體破碎和細胞死亡，因此保護糖尿病患者心肌的UPS可能成為改善心功能的關鍵措施之一。

4 問題與展望

轉運系統(tǒng)和降解系統(tǒng)的正常運作是保證線粒體健康的重要前提。在TOM、PAM、TIM23和TIM22等轉位酶復合物的協(xié)作下，轉運系統(tǒng)將重要的線粒體蛋白以前體形式運送至對應的亞區(qū)進行下一步加工和組裝；而降解系統(tǒng)則通過mtUPR、MAD等途徑最大限度地維持蛋白穩(wěn)態(tài)平衡。通過對已有研究的梳理發(fā)現(xiàn)，DCM與這兩個系統(tǒng)的關系密不可分。ETC的破壞導致ATP生成減少和ROS積累，ROS增多進一步損傷ECT復合物，形成惡性循環(huán)。這些因素都會對轉運系統(tǒng)和降解系統(tǒng)造成不同程度的負面影響(圖1)。

圖1 DCM線粒體功能障礙的機制Fig 1 Mechanisms of mitochondrial dysfunction in DCM

目前為止，大部分的實驗以酵母菌、線蟲等為主要對象，但人類線粒體中轉運系統(tǒng)和降解系統(tǒng)的成分與低等真核生物之間仍存在不同程度的差異，未來的研究應圍繞哺乳動物以及人類細胞展開，致力于確定線粒體蛋白質量控制的分子機制和糖尿病心肌線粒體存在的相關缺陷。mtUPR在人體中如何調控核基因表達和胞質蛋白翻譯？MAD途徑所能降解的底物還有哪些？糖尿病心肌細胞中有哪些相關基因的表達受到抑制？在今后的科研中，線粒體仍然是糖尿病等代謝疾病的研究熱點，通過實驗進一步探究其在糖尿病心肌中發(fā)生的變化及分子機制可能為治療DCM提供新的思路。