聶小華，劉海珍，唐麒雯，吳聰聰，孫培龍

(浙江工業(yè)大學 食品科學與工程學院，浙江 杭州 310014)

我國淡水魚資源豐富，其中大宗低值淡水魚(青、草、鰱、鳙和鯉等)的產(chǎn)量占淡水魚總量的60%以上，其加工方式主要為冷凍、腌制[1]、熏制以及魚糜加工[2-3]，但與大豆、牛乳等相比，魚類蛋白資源尚未得到充分利用。肌原纖維蛋白是魚肉中的重要蛋白，約占總蛋白的60%，其主要成分為肌球蛋白和肌動蛋白，均可在低鹽環(huán)境中發(fā)生分子間的自組裝，形成不溶性微絲[4]，從而很大程度上限制了魚類肌原纖維蛋白的功能性質(zhì)。到目前為止，對肌原纖維蛋白的修飾主要集中于糖基化、超聲波、靜高壓和酚類等[5-8]方法。近年來，人們開始探究均質(zhì)對雞肉、貝類來源肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)修飾，改善其功能性質(zhì)[9-10]，以期擴展其在食品工業(yè)中的應(yīng)用領(lǐng)域。

均質(zhì)處理是食品工業(yè)中普遍應(yīng)用的一種加工方式，處理過程中存在壓力、空化、剪切和湍流等機械作用力。當壓力達到一定程度時，產(chǎn)生的強烈機械作用力可將蛋白質(zhì)聚集體顆粒微細化，甚至發(fā)生聚集體解聚，影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，改變其功能性質(zhì)[11]?；诓煌N源的肌原纖維蛋白存在著結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的差異，筆者以大宗淡水魚——花鰱肌原纖維蛋白為研究對象，采用低壓均質(zhì)(10～40 MPa)處理肌原纖維蛋白，評價其在低鹽環(huán)境中的溶解狀態(tài)及其界面性質(zhì)、流變學性質(zhì)，為改善魚類肌原纖維蛋白功能性質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活花鰱，購于杭州市朝暉六區(qū)農(nóng)貿(mào)市場；5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、8-苯胺基-1-萘磺酸鈉(ANS)、牛血清白蛋白(BSA)、考馬斯亮藍R-250、蛋白質(zhì)分子量標準(寬)、考馬斯亮藍G-250、過硫酸銨、TEMED、丙烯酰胺和雙丙烯酰胺均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；EDTA，都萊生物有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，西隴化工股份有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

納米粒度及Zeta電位分析儀，美國布魯克海文儀器公司；GJJ-0.06/60高壓均質(zhì)機，溫州桑田流體設(shè)備有限公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀，美國Bio-Rad公司；T18高速分散機，德國IKA集團；MCR52流變儀，安東帕上海商貿(mào)有限公司；UV-759紫外可見分光光度計，上海奧譜勒儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的制備

取魚肉攪碎，置于5倍體積的冰水中勻漿處理(8 000 r/min，1 min)，離心(10 000g，20 min)，收集沉淀，如上反復處理2次；沉淀置于6倍體積的0.6 mol/L NaCl中勻漿，放置1 h，離心(10 000g，20 min)。取上清液加入10倍體積的水，沉淀，離心(10 000g，20 min)，所得到的沉淀即為肌原纖維蛋白。上述操作均在4 °C下進行。蛋白質(zhì)含量測定采用雙縮脲法。

1.3.2 肌原纖維蛋白的低壓均質(zhì)處理

將肌原纖維蛋白分散于0.15 mol/L NaCl冰水中，調(diào)整其質(zhì)量濃度為5 mg/mL，采用均質(zhì)機在10，20，30，40 MPa下連續(xù)進行4 次循環(huán)，每次循環(huán)后快速冷卻到4 ℃。所有樣品置于4 ℃下以備分析。

1.3.3 粒徑和Zeta電位的測定

采用Zeta電位及粒度分析儀測定。調(diào)整樣品蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，檢測角度為90°，測試時間 2 min，測定溫度25 ℃。

1.3.4 溶解度的測定

將樣品離心(10 000g，20 min)，收集上清液。采用雙縮脲法測定樣品離心前后的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，溶解度(%)為樣品離心前后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的比值。

1.3.5 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

采用李長樂方法[12]測定乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)。9 mL樣液和3 mL大豆油混合，于11 000 r/min下勻漿1 min制備成乳濁液，立即取出50 μL加到質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS溶液中，混勻，500 nm下測定吸光度A0。乳濁液靜置 10 min 后，如上測定得到A10。EAI和ESI的計算式分別為

式中：DF為稀釋倍數(shù)；F為乳體積分數(shù)(0.25)；C為蛋白質(zhì)量濃度，g/mL；Δt為放置時間，10 min。

1.3.6 起泡能力和起泡穩(wěn)定性的測定

采用常海霞[13]方法測定起泡能力(FC)和起泡穩(wěn)定性(FS)。5 mL樣液和10 mL蒸餾水混合后，記為V，于11 000 r/min下勻漿1 min，記錄勻漿后體積V0。室溫下放置30 min，記錄泡沫體積V30。FC和FS的計算式分別為

1.3.7 表觀黏度的測定

使用MCR 52旋轉(zhuǎn)流變儀獲得樣品的流動曲線。轉(zhuǎn)子型號PP75，測量間距1 mm，測試過程中保持溫度25 ℃，剪切黏度范圍0～100 s-1。

1.3.8 動態(tài)流變學性質(zhì)的測定

使用MCR 52旋轉(zhuǎn)流變儀測定乳狀液的動態(tài)流變性。測定條件：轉(zhuǎn)子型號PP75，頻率0.1 Hz，應(yīng)變1%，平行板間距1 mm；溫度控制采用程序升溫，升溫范圍20～90 ℃，升溫速率1 ℃/min。加樣后為防止樣品水分蒸發(fā)，用液體石蠟或硅油密封。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

實驗各組數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，利用SPSS 22.0進行分析處理，繪圖采用Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 粒徑的變化

低壓均質(zhì)對低鹽環(huán)境中花鰱肌原纖維蛋白平均粒徑的影響如圖1所示。隨著處理壓力的增加，肌原纖維蛋白的粒徑分布變得更加均勻，粒徑逐步變小，其平均粒徑發(fā)生下降；當處理壓力為40 MPa時，平均粒徑由原來的1 653 nm降至485 nm，降低了70.66%。均質(zhì)處理過程產(chǎn)生的壓力、空化、剪切和湍流等機械作用力可破壞大顆粒物料的結(jié)構(gòu)，形成更小的顆粒，導致蛋白聚集體粒徑減小，相似的結(jié)果已被廣泛報道[10,14]。聚集體粒徑的減少，也意味著其表面積增加，進而促進蛋白質(zhì)和溶劑之間的相互作用，有助于肌原纖維蛋白在低鈉環(huán)境中的溶解和功能特性。

圖1 低壓均質(zhì)對魚肌原纖維蛋白粒徑的影響Fig.1 Effect of low pressure homogenization on the size of fish myofibrillar protein

2.2 Zeta電位的變化

Zeta電位反映蛋白質(zhì)表面的凈電荷，當凈電荷較高時可增加靜電斥力，從而改變蛋白聚集狀態(tài)[14]。低壓均質(zhì)對低鹽環(huán)境中花鰱肌原纖維蛋白Zeta電位的影響如圖2所示。隨著均質(zhì)壓力增加，肌原纖維蛋白的電位絕對值顯著升高，從原來的6.32 mV增至8.43 mV(40 MPa)。靜電引力是形成肌球蛋白棒狀尾部和微絲的重要作用力[4]，該結(jié)果說明：低壓均質(zhì)破壞了肌原纖維蛋白原有的靜電引力，促使其負電荷官能團(如—COO-)從掩蔽的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)表面，增強蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，從而使得聚集體發(fā)生解離，同時穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子[15]。

圖2 低壓均質(zhì)對魚肌原纖維蛋白Zeta電位的影響Fig.2 Effect of low pressure homogenization on Zeta potential of fish myofibrillar protein

2.3 溶解度的變化

低壓均質(zhì)對低鹽環(huán)境中花鰱肌原纖維蛋白溶解度的影響如圖3所示。由圖3可知：肌原纖維蛋白在低鹽環(huán)境中呈現(xiàn)出一定的溶解度(44.46%)，高于陳星的研究結(jié)果[16]，這可能與原料、提取方法和分散體系等相關(guān)。隨著處理壓力的增加，肌原纖維蛋白在低鹽環(huán)境中溶解度逐漸增加，且與處理壓力存在正相關(guān)；當處理壓力為40 MPa時，肌原纖維蛋白溶解度由44.46%增加至59.76%，提高了14%。這意味著低壓均質(zhì)過程中蛋白聚集體發(fā)生一定程度的解離，甚至影響到分子的空間結(jié)構(gòu)，從而提高其溶解度，這也與其粒徑減小和Zeta電位絕對值增加等相關(guān)。但由于均質(zhì)壓力較低，對肌原纖維蛋白的增溶效果遠低于已有報道[16]。

圖3 低壓均質(zhì)對魚肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.3 Effect of low pressure homogenization on solubility of fish myofibrillar protein

2.4 乳化性質(zhì)的變化

低壓均質(zhì)對低鹽環(huán)境中花鰱肌原纖維蛋白乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的影響如圖4所示。隨著均質(zhì)壓力的增加，肌原纖維蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)不斷上升趨勢，經(jīng)40 MPa均質(zhì)處理后乳化活性由11.79 m2/g提高到21.37 m2/g，乳化穩(wěn)定性由16.33 min提高到22.20 min。由此推測肌原纖維蛋白溶解度的提高和粒徑的減小，促進了其快速遷移到油水界面，從而提高乳化活性。已有文獻表明：更小的聚集體和可溶性蛋白質(zhì)可快速向油-水界面擴散，提高其吸附于界面上的數(shù)量[17]。此外，低壓均質(zhì)過程中產(chǎn)生的機械作用力可能促使肌原纖維蛋白發(fā)生去折疊和疏水暴露，這有助于蛋白質(zhì)分子和油或蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用[18]。同時，低壓均質(zhì)處理后肌原纖維蛋白的Zeta電位絕對值得到提高，有利于乳狀液的穩(wěn)定性。

圖4 低壓均質(zhì)對魚肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of low pressure homogenization on emulsifying activity and stability of fish myofibrillar protein

2.5 起泡性質(zhì)的變化

低壓均質(zhì)對低鹽環(huán)境中花鰱肌原纖維蛋白的起泡能力(FC)和起泡穩(wěn)定性(FS)的影響如圖5所示。隨著均質(zhì)壓力增大，肌原纖維蛋白的起泡能力隨之增加，經(jīng)40 MPa均質(zhì)處理后起泡能力由28.21%提高到73.33%。通常，蛋白質(zhì)起泡能力與其在氣-水界面的快速大量吸附能力有關(guān)。溶解度的增加和聚集體尺寸粒徑的降低對泡沫形成有著促進影響。此外，低壓均質(zhì)處理后肌原纖維蛋白起泡性穩(wěn)定性變化不大。這與Yang等[17]的結(jié)果相類似，可能是由于肌原纖維蛋白自身表現(xiàn)出較高的起泡穩(wěn)定性所致。

圖5 低壓均質(zhì)對魚肌原纖維蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of low pressure homogenization on foaming capacity and stability of fish myofibrillar protein

2.6 表觀黏度的變化

低壓均質(zhì)對低鹽環(huán)境中花鰱肌原纖維蛋白表觀黏度的影響如圖6所示。由圖6可知：隨著剪切速率的增加，肌原纖維蛋白的表觀黏度均發(fā)生明顯下降，呈現(xiàn)剪切稀化現(xiàn)象，說明其為假塑性流體。經(jīng)低壓均質(zhì)處理后，肌原纖維蛋白的表觀黏度有一定程度的降低，說明其更易發(fā)生剪切稀化，且該現(xiàn)象與處理壓力存在正相關(guān)。這可能與其粒徑減小和溶解度增加相關(guān)。已有研究表明：蛋白分散體的流動行為受到顆粒特性(如粒徑分布、形狀和大小)的影響[14]。肌原纖維蛋白是一個以肌球蛋白和肌動蛋白為主組成的混合體系，在低鹽環(huán)境中自組裝成微絲，聚集體粒徑較大時，剪切過程中大顆粒相互攪拌在一起，增加了溶液流動的阻力。經(jīng)低壓均質(zhì)處理后，肌原纖維蛋白分散體系中聚集體平均粒徑減小，可降低分散體系流動過程中的阻力。

圖6 低壓均質(zhì)對魚肌原纖維蛋白表觀黏度的影響Fig.6 Effect of low pressure homogenization on apparent viscosity of fish myofibrillar protein

2.7 動態(tài)流變學性質(zhì)

低壓均質(zhì)對低鹽環(huán)境中花鰱肌原纖維蛋白儲能模量G′和損耗模量G″的變化如圖7所示，以此表征其在加熱過程中黏彈性變化。由圖7(a)可知：低鹽環(huán)境中肌原纖維蛋白G′隨溫度逐步增加，在38 ℃時達到最大值，然后發(fā)生一定程度的下降，之后隨著溫度的升高快速上升，至65 ℃后趨于平緩；而G″從46 ℃開始有明顯增加，50 ℃時達到最大值，于60 ℃趨于穩(wěn)定并有一定程度下降。相似的結(jié)果也發(fā)生在生理條件下的豬肉肌球蛋白中[19]。經(jīng)低壓均質(zhì)處理后，肌原纖維蛋白G′和G″均發(fā)生明顯的下降，且變性峰減弱甚至消失。這可能是均質(zhì)處理使得部分微絲發(fā)生解離，增加了肌原纖維蛋白的溶解度，分子間相互作用變小，增加了蛋白質(zhì)體系的流動性，從而G′值降低。有研究表明：46～60 ℃黏彈性變化可能與肌球蛋白變性有關(guān)，G″在46～50 ℃上升可能是肌球蛋白頭部結(jié)合所致，到達峰值之后的急劇下降可能是肌球蛋白尾部展開[20]。陳星[16]認為：水溶性肌原纖維蛋白熱膠凝能力大幅降低應(yīng)歸因于其肌球蛋白螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解離，且產(chǎn)生了二硫鍵介導的低聚體。上述結(jié)果說明：均質(zhì)處理阻礙了肌球蛋白(肌原纖維蛋白主要成分)的頭部結(jié)合和尾部交聯(lián)[16, 21]，其熱聚集能力降低。

圖7 低壓均質(zhì)對魚肌原纖維蛋白動態(tài)流變學性質(zhì)的影響Fig.7 Effect of low pressure homogenization on dynamic rheology of fish myofibrillar protein

3 結(jié) 論

采用均質(zhì)壓力(10～40 MPa)、4 次低壓均質(zhì)處理能夠改變肌原纖維蛋白在低鹽環(huán)境中的功能性質(zhì)。低壓均質(zhì)可促使肌原纖維蛋白微絲發(fā)生解離，粒徑降低，同時使得荷電基團暴露在顆粒表面，Zeta電位增加，使其在水中的溶解度增加，如40 MPa下均質(zhì)處理后其溶解度增加到59.76%，且肌原纖維蛋白的乳化活性和起泡能力分別提高了81.25%和161.14%。但低壓均質(zhì)同時也導致肌原纖維蛋白更易發(fā)生剪切變稀現(xiàn)象，加熱過程中儲能模量和損耗模量發(fā)生明顯下降，說明均質(zhì)處理會抑制肌球蛋白的頭部結(jié)合與尾部交聯(lián)，降低其熱聚集能力，關(guān)于均質(zhì)處理過程中結(jié)構(gòu)的變化機理有待進一步研究。