徐 航，劉賢青，袁弘倫，羅 杰

（海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院/海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

檳榔（Areca catechuL.），別名儐郎、賓門等，是棕櫚科多年生常綠喬木，原產(chǎn)馬來西亞，廣泛分布于南亞、東南亞[1]。我國(guó)主要栽種于海南島、臺(tái)灣、廣東、廣西和福建等地。檳榔是一種具有較高藥用價(jià)值的中藥，位居我國(guó)“四大南藥”之首[2]，主要用于治療寄生蟲病、消化不良、腹脹、腹痛、腹瀉、水腫和黃疸等疾病[3]。同時(shí)，檳榔也是深受消費(fèi)者喜愛的咀嚼食品[4]。據(jù)估計(jì)，在中國(guó)、南亞和東非等國(guó)家和地區(qū)，每天有超過4億人以不同的食用方式咀嚼檳榔[5?6]。然而，咀嚼檳榔也具有一定的健康風(fēng)險(xiǎn)，例如嚼食檳榔與口腔癌關(guān)系密切[7]，檳榔果的水提物和檳榔堿能顯著地上調(diào)口腔黏膜成纖維細(xì)胞中c-jun原癌基因的表達(dá)[8]，檳榔果的水提物能通過上調(diào)細(xì)胞間黏附分子?1（ICAM-1）的表達(dá)，而對(duì)體外培養(yǎng)的人類口腔黏膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生明顯的增生作用，從而導(dǎo)致口腔黏膜下纖維化[9]。

檳榔的促消化、抗氧化、抗寄生蟲、抗抑郁等藥用活性與其包含的多種代謝產(chǎn)物密切相關(guān)[10]。檳榔中的化學(xué)成分主要包括糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、粗纖維、多酚，同時(shí)包含0.2%～1.7%的生物堿[11]。PENG等[1]鑒定了檳榔中的59種化合物，包括生物堿、類黃酮、單寧、三萜和脂肪酸等，并發(fā)現(xiàn)吡啶類生物堿和縮合單寧是檳榔中的特征代謝物。檳榔中的吡啶類生物堿主要有檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿和去甲基檳榔次堿等4種，另外，還包含檳榔副堿、煙酸、煙酸甲酯、煙酸乙酯、N?甲基?1,2,5,6?四氫吡啶?3?羧酸乙酯、N?甲基哌啶?3?羧酸甲酯、N?甲基哌啶?3?羧酸乙酯、異去甲基檳榔次堿、高檳榔堿等9種生物堿[1]。近年來，隨著分離手段的改進(jìn)和檢測(cè)技術(shù)的提高，TANG等[12]從檳榔中發(fā)現(xiàn)了3種新的生物堿，Arecatemine A、Arecatemine B和Arecatemine C，CAO等[13]報(bào)道了2種新的生物堿，分別為3?羧甲基丁酯吲哚1?N?β?D?吡喃葡萄糖苷和3?甲氧基?4?羥基苯基6?O?（2?氨基?1?氧代?3?苯基丙基)?β?D?吡喃葡萄糖苷。

目前，對(duì)檳榔堿的研究和報(bào)道主要集中在檳榔堿的藥理、毒理活性及化學(xué)工藝合成上[14?16]，其合成通路尚不清楚，這制約了對(duì)檳榔堿代謝調(diào)控與進(jìn)化分子機(jī)理的深入研究，也阻礙了食用型低檳榔堿含量檳榔和藥用型高檳榔堿含量檳榔的選育。代謝組學(xué)是研究物質(zhì)合成通路的有效手段[17]。代謝組學(xué)本質(zhì)上是指某一生物、組織或細(xì)胞中的所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性與定量分析的一門科學(xué)[18]。代謝組學(xué)研究中較常見的分析手段有色譜法、質(zhì)譜法、核磁共振波譜法、紫外吸收光譜法和紅外吸收光譜法等[19]。應(yīng)用最廣泛、最有效的是氣相色譜?質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜?質(zhì)譜（LC-MS）[20]。色譜與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了從利用色譜進(jìn)行物質(zhì)分離到利用質(zhì)譜進(jìn)行物質(zhì)鑒定的整個(gè)流程。其中，LC-MS能分析極性與相對(duì)分子質(zhì)量較高及熱穩(wěn)定性差的化合物，具有前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍廣和檢測(cè)效率高等優(yōu)勢(shì)，是現(xiàn)階段代謝組學(xué)最常用的檢測(cè)手段[21]。LC-MS檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)使其適合作為代謝通路解析的工具。因此，可利用基于LCMS的代謝組學(xué)研究檳榔代謝物，并解析檳榔堿的合成通路。

本研究利用HPLC-OBITRAP-MS對(duì)檳榔各組織進(jìn)行了非靶向代謝組檢測(cè)，獲得了大量的代謝信號(hào)，通過對(duì)代謝信號(hào)中二級(jí)碎片的結(jié)構(gòu)注釋，鑒定了超過150種代謝物，首次發(fā)現(xiàn)檳榔中存在糖基化的檳榔次堿。通過對(duì)代謝數(shù)據(jù)的定量分析，發(fā)現(xiàn)了氨基酸和生物堿空間分布的特異性。通過查閱檳榔堿結(jié)構(gòu)類似物天然合成途徑的文獻(xiàn)，參考KEGG數(shù)據(jù)庫中的信息，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)獲得的代謝物數(shù)據(jù)，推測(cè)了檳榔堿的可能合成途徑，旨在為進(jìn)一步探究檳榔堿的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、來源、檳榔藥理活性和毒理機(jī)制等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料在海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院基地的檳榔種植區(qū)，隨機(jī)采摘大小、果形基本一致的成熟檳榔果實(shí)12枚（重復(fù)3次），將果實(shí)分解為果皮、果殼和果仁。采摘同種不同株檳榔樹的根、莖、葉各3份，混合不同株的樣品后，隨機(jī)分為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將樣品進(jìn)行液氮冷凍處理后，在?80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器主要試劑：甲醇、乙腈和乙酸（德國(guó)Merck公司）、去離子水（Millipore純化系統(tǒng)處理）、代謝樣品內(nèi)標(biāo)利多卡因（上海新亞藥業(yè)有限公司）、4種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。標(biāo)準(zhǔn)品用φ=70%的甲醇溶劑進(jìn)行溶解，配置好的標(biāo)準(zhǔn)品置于?20℃冰箱避光儲(chǔ)存。

主要儀器：BM 500高性能球磨儀（奧地利Anton Paar公司），Delta 2-24 LSC plus冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司），5427型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），高效液相色譜?軌道離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）等。

1.3 樣品準(zhǔn)備與提取不同組織的檳榔樣品真空冷凍干燥7 d后，用BM500球磨儀研磨成粉末（頻率30 Hz、持續(xù)時(shí)間1.5 min）。稱取100 mg研磨好的干粉樣品，加入1.2 mL含有0.1 mg·L?1利多卡因內(nèi)標(biāo)的φ=70%甲醇提取液，渦旋30 s，低溫靜置10 min，重復(fù)上述操作3次后，放入4℃冰箱繼續(xù)萃取代謝產(chǎn)物12 h，10 000 g 4℃離心10 min，取上清液，用0.22μm的濾膜過濾后，放入進(jìn)樣瓶中即可用于LC-MS進(jìn)行代謝物檢測(cè)分析。

1.4 儀器條件與參數(shù)選取UPLC-Thermo Scientific Q EXACTIVE plus系統(tǒng)中Full MS/dd-MS2的模式進(jìn)行代謝物檢測(cè)。儀器：高效液相色譜（UltiMate 3000）?四級(jí)桿?Orbitrap（QEXACTIVE plus）高分辨質(zhì)譜（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。色譜條件：色譜柱為shim-pack VP-OSD（pore size 5.0 um）C18（日本島津公司），流動(dòng)相為水（含φ=0.04%乙酸）和乙腈（含φ=0.04%乙酸）。洗脫梯度：V水∶V乙腈= 95∶5，0 min；V水∶V乙腈=5∶95，10.0 min；V水∶V乙腈=5∶95，11.0 min；V水∶V乙腈=95∶5，11.1 min；V水∶V乙腈=95∶5，15.0 min。流速為0.35 mL·min?1；柱溫為40℃，進(jìn)樣量為2μL。質(zhì)譜條件：ESI（電噴霧離子源）；正離子模式；鞘氣輔助流速比例為40；輔助氣流速比例為15；噴霧電壓3 000 V；毛細(xì)管溫度360℃；S-lens電壓55.0 V；輔助氣加熱溫度350℃；離子掃描范圍質(zhì)荷比m/z67～1 000。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析利用Compound discover（Compound Discover 3.1.0.305，Thermo）軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。首先，在軟件中創(chuàng)建新的定量分析方法，導(dǎo)入原始的下機(jī)數(shù)據(jù)，根據(jù)樣品類型對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，最后，選擇合適的工作流（workflow），調(diào)整相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行提取質(zhì)譜圖、色譜峰對(duì)齊、物質(zhì)定性和相對(duì)定量等分析。主要參數(shù)設(shè)置如下：前體離子掃描范圍0～2 000 Da，信噪比閾值大于1.5，最大轉(zhuǎn)換時(shí)間2 min，最小峰強(qiáng)度106，保留時(shí)間的誤差范圍0.1 min。利用TBtools軟件中的主成分分析(principle component analysis，PCA)功能完成不同組織部位代謝物特征積累的分析。利用R 3.5.1和pheatmap包來完成熱圖的繪制，利用Origin 2018來完成色譜圖和質(zhì)譜圖的繪制。利用ChemSketch 12.0完成代謝通路流程圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔各組織的表型及代謝物輪廓分析為研究檳榔全株(圖1-A)的代謝差異，采集了正常生長(zhǎng)時(shí)期檳榔的根(Root)、莖(Stem)、葉(Leaf)和果實(shí)，把檳榔果實(shí)的外果皮(Esocarp)、中果皮(Mesocarp)和內(nèi)果皮(Endocarp)種子(Seed)進(jìn)行分離(圖1-B)。

圖1 檳榔表型及各組織代謝譜分析Fig. 1 Phenotype and the metabolic profile of Areca catechu L.

正離子模式下進(jìn)行非靶向代謝檢測(cè)，所有組織共得到18 386個(gè)代謝信號(hào)，去除Q1、RT和碎片信息一致的重復(fù)信號(hào)以及沒有碎片信息的信號(hào)，以7 508個(gè)代謝信號(hào)的定量信息進(jìn)行PCA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過PC1和PC2可以明顯區(qū)分不同組織，表明根、莖、葉、外果皮、中果皮和種子在代謝水平上有明顯的差異(圖1-C)，PC1能非常顯著地區(qū)分葉和其他組織。果實(shí)的PCA分析同樣也顯示出了外果皮、中果皮和種子的代謝差異(圖1-D)。

2.2 檳榔中代謝物的定性分析檳榔中代謝物的定性可通過標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)、代謝數(shù)據(jù)庫匹配和譜圖解析3種方式進(jìn)行。首先將4種檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)品按與檳榔樣品相同的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行HPLC-ORBITRAPMS/MS檢測(cè)。與之前檳榔樣品的代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，質(zhì)荷比m/z、RT和碎片裂解模式均相同的為同一物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)各組織檳榔樣品中均含有檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿和去甲基檳榔次堿。通過m/zCloud數(shù)據(jù)庫、m/zVault數(shù)據(jù)庫和ChemSpider數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線匹配，m/zCloud數(shù)據(jù)庫和m/zVault數(shù)據(jù)庫分別匹配到得分大于60分的276個(gè)和199個(gè)代謝物，ChemSpider數(shù)據(jù)庫匹配得到1 956個(gè)代謝物，由于ChemSpider數(shù)據(jù)庫只有一級(jí)碎片匹配，因此，結(jié)果并不具有較好的可靠性。之后對(duì)匹配的結(jié)果進(jìn)行去重和檢查，共鑒定得到152個(gè)代謝物，主要為氨基酸及其衍生物、生物堿、類黃酮、脂質(zhì)、核苷酸和吲哚及其衍生物。其中，生物堿之一的葫蘆巴堿首次在檳榔中被鑒定到。

對(duì)于仍未注釋的物質(zhì)，通過譜圖解析進(jìn)行定性[22?23]。常見的檳榔生物堿可分為哌啶環(huán)上有甲基取代的檳榔生物堿和無甲基取代的檳榔生物堿兩類，依據(jù)檳榔堿和檳榔次堿的標(biāo)準(zhǔn)品可知前者母核的特征碎片為124.076 2和81.034 0，對(duì)于檳榔次堿來說，其他碎片為96.081 3，由此可得檳榔次堿的裂解模式為：首先脫一分子水得到124.076 2的特征碎片，在此基礎(chǔ)上哌啶環(huán)上的1個(gè)C-N鍵和1個(gè)C-C鍵斷裂，得到81.034的碎片，同時(shí)哌啶環(huán)掉落得到96.081 3的碎片。對(duì)于檳榔堿來說，其他碎片為113.059 6和96.081 3。因此，可以利用特征碎片結(jié)合保留時(shí)間來合理推測(cè)檳榔堿衍生物。從7 508個(gè)代謝信號(hào)中，篩選二級(jí)碎片包含124和81的并且強(qiáng)度為前10的代謝信號(hào)，共得到102個(gè)代謝物，進(jìn)一步篩選二級(jí)譜圖后，得到18個(gè)潛在的檳榔堿衍生物，1個(gè)因保留時(shí)間相比于檳榔堿提前0.21 min，且二級(jí)碎片完全一致，被注釋為檳榔副堿。在這18個(gè)潛在的檳榔堿衍生物中，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)糖基化的檳榔次堿，檳榔次堿己糖苷，結(jié)構(gòu)和主要的碎片斷裂模式如圖2-A所示，該物質(zhì)的保留時(shí)間（圖2-B）相比于檳榔次堿提前，并且含有162.052 5的六碳糖中性丟失(圖2-C)。本實(shí)驗(yàn)利用標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)、代謝數(shù)據(jù)庫匹配和譜圖解析的方式共解析了158種代謝物。

圖2 檳榔次堿己糖苷的鑒定Fig. 2 Identification of arecaidine hexoside

2.3 檳榔堿合成前體物質(zhì)的空間分布基于對(duì)定性的代謝物進(jìn)行相對(duì)定量。從圖3可知，檳榔各組織中，共檢測(cè)到18種氨基酸。從對(duì)氨基酸含量的聚類(圖3-A)來看，主要分為三類，一類在種子中具有高含量，并且生殖器官(果實(shí)、種子)中的含量高于營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖、葉)，包括芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)和支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)等；一類在中果皮和內(nèi)果皮中含量較高，為天冬氨酸和天冬酰胺，天冬氨酸作為檳榔堿生物合成的前體物質(zhì)，其在生殖器官中的含量也高于營(yíng)養(yǎng)器官；另一類在葉片中含量最高，為絲氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸和半胱氨酸。除甘氨酸外，其他氨基酸在果實(shí)中具有較高的含量（種子中含量最高，中果皮次之，外果皮最低）。生物堿的熱圖(圖3-B)顯示，煙酸衍生物(煙酰胺、煙酸乙酯、尼古丁)在葉片中含量較高，檳榔次堿己糖苷和去甲基檳榔次堿在外果皮中含量較高，其他生物堿均顯示出在果實(shí)中尤其是種子中有較多的積累。

圖3 檳榔中氨基酸和生物堿的相對(duì)定量分析Fig. 3 Relative quantitative analysis of amino acids and alkaloids in Areca catechu L.

2.4 檳榔堿的通路解析由于檢測(cè)到高含量的葫蘆巴堿，基于葫蘆巴堿與檳榔堿的結(jié)構(gòu)相似性，筆者合理推測(cè)了一條檳榔堿的合成途徑(圖4)。檳榔堿均含有被還原的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)，其合成由煙酸（nicotinic acid）作為基本骨架。吡啶環(huán)的合成途徑起始于L?天冬氨酸，其在天冬氨酸氧化酶(aspartate oxidase,AO)催化下氧化形成α?亞氨基琥珀酸(α-iminosuccinic acid)[24]。然后，α?亞氨基琥珀酸和3?磷酸甘油醛在喹啉酸合成酶(quinolinate synthase, QS)催化下形成了喹啉酸（quinolinic acid）[24]，接著喹啉酸在喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase, QPT)的催化作用下形成煙酸單核苷酸(NAMN)，以此進(jìn)入吡啶核苷酸循環(huán)，進(jìn)而形成煙酸[25]。緊接著，在煙酸 N?甲基轉(zhuǎn)移酶(nicotinate Nmethyltransferase, NMT)的作用下，煙酸轉(zhuǎn)化為葫蘆巴堿[26]。

圖4 推測(cè)的檳榔堿生物合成途徑Fig. 4 Putative biosynthetic pathway of arecoline

煙酸與去甲基檳榔次堿的結(jié)構(gòu)非常相似，區(qū)別僅是煙酸為吡啶環(huán)而去甲基檳榔次堿為哌啶環(huán)，故推測(cè)去甲基檳榔次堿由煙酸衍生而來。通過檢索KEGG數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)在莨菪烷、哌啶和吡啶類生物堿的生物合成途徑中還存在煙酸還原為3,6?二氫煙酸的步驟，結(jié)合去甲基檳榔次堿的結(jié)構(gòu)，推測(cè)這一步驟在檳榔中也存在。3,6?二氫煙酸在還原酶和異構(gòu)酶的作用下生成去甲基檳榔次堿，去甲基檳榔次堿在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成去甲基檳榔堿。同時(shí)葫蘆巴堿與檳榔次堿的結(jié)構(gòu)也十分相似，區(qū)別為葫蘆巴堿為吡啶環(huán)而檳榔次堿為哌啶環(huán)，故推測(cè)檳榔次堿由葫蘆巴堿衍生而來。葫蘆巴堿在還原酶和異構(gòu)酶的作用生成檳榔次堿，檳榔次堿在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成檳榔堿。同時(shí)，可能還存在1個(gè)與NMT類似功能的甲基轉(zhuǎn)移酶，行使母核四氫吡啶和母核甲基四氫吡啶的相互轉(zhuǎn)化。由于檢測(cè)到了檳榔次堿己糖苷，說明有1個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶催化檳榔次堿的糖基化步驟。

3 討 論

從氨基酸和生物堿的空間分布可以看到，幾乎所有的氨基酸、大部分生物堿在種子中的含量高于外果皮、中果皮和內(nèi)果皮，并且對(duì)于人體所需的8種必需氨基酸。除蘇氨酸外，其余7種均在種子中含量最高，說明種子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于其他組織，但用于食用的檳榔加工品常常舍棄種子的部分，只包含外果皮、中果皮和內(nèi)果皮。這對(duì)檳榔加工有了新的見解：在工藝允許的情況下，保留種子的部分更能提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。天冬氨酸的積累模式與葫蘆巴堿、檳榔堿較為類似，均為在果實(shí)中尤其是種子中含量較高，進(jìn)一步證實(shí)了本研究提出的檳榔堿合成途徑的合理性，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，去甲基檳榔次堿和檳榔次堿己糖苷的積累模式與其他生物堿有較大的差異。

現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，葫蘆巴堿在豆類、咖啡和月橘中有積累[25,27?28]，同時(shí)，也揭示了葫蘆巴堿的代謝途徑（咖啡、綠豆、馬鈴薯和水稻）[29?31]，筆者在檳榔中檢測(cè)到葫蘆巴堿，才有了推測(cè)檳榔堿合成途徑的物質(zhì)基礎(chǔ)。檳榔堿合成途徑中，天冬氨酸至葫蘆巴堿和3,6?二氫煙酸的合成途徑較清楚，在水稻、煙草中均有此步驟，較保守，且其中的酶在煙草等物種中已經(jīng)鑒定。檳榔堿目前僅在檳榔屬植物中報(bào)道，是檳榔中主要的生物堿，而在煙草中煙堿是主要的生物堿，故可以比較兩者的異同，煙堿吡啶環(huán)的結(jié)構(gòu)與檳榔堿吡啶環(huán)的結(jié)構(gòu)類似，兩者合成途徑中均利用煙酸作為前體，不同的是，煙堿途徑中煙酸的吡啶環(huán)與吡咯烷環(huán)縮合成煙堿，而檳榔堿途徑中不存在縮合的步驟，吡啶環(huán)通過還原異構(gòu)的方式形成檳榔次堿。在煙堿代謝途徑中，催化喹啉酸形成煙酸前體煙酸單核苷酸的喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(QPT)是限速步驟[32]，在檳榔堿的合成途徑中，QPT也可能是限速步驟。

檳榔堿對(duì)消化系統(tǒng)疾病具有正面作用，但對(duì)口腔黏膜具有負(fù)面作用。隨著檳榔堿代謝途徑的解析，將有助于培育食用型低檳榔堿含量檳榔和藥用型高檳榔堿含量檳榔，促進(jìn)檳榔產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。