占昭宏，林玉暖，米 多，魏炳錚，牛曉磊，陳銀華，陶 均，李春霞

（海南大學 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室/熱帶作物學院，海口 570228）

水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起的一種破壞性極大的病害,長期以來對水稻的產(chǎn)量造成巨大的損失。在病原菌與水稻的互作過程中，水稻細胞可識別來自病原菌的信號分子從而觸發(fā)免疫防御，而病原菌也進化出特殊的機制來抑制或逃脫宿主產(chǎn)生的免疫反應而成功侵染。在此過程中，由Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ Secretion System, T3SS)分泌的效應因子(Type Ⅲ Secretion Effectors, T3SEs)起到關鍵性的作用。一方面，部分T3SEs可抑制植物細胞的天然免疫途徑而起到促進細菌侵染的作用；另一方面，植物進化出了一些新防御策略：植物細胞可識別部分T3SEs而觸發(fā)免疫反應，限制病原菌的侵染。在反復的斗爭過程中，細菌又進化出了部分T3SEs來抑制由效應因子激活的免疫反應。此過程循環(huán)往復，病原菌與植物協(xié)同進化，共同決定病原菌與植物的關系[1?2]。因此，解析T3SE的功能及調(diào)控途徑對理清病原菌?植物的互作關系至關重要。通過泌出信號肽氨基酸組成、保守結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)的無序性、HrpX和HrpG是否調(diào)控、GC含量和密碼子偏好性以及同源性等分析是預測效應蛋白的主要手段[3]。Xoo中有2類T3SEs：一類是轉(zhuǎn)錄激活子類效應蛋白(Transcription Activation-Like Effectors, TALEs)，可與水稻易感性基因啟動子的結(jié)合調(diào)控宿主基因表達[4?6]，但并不是所有Xoo菌株都有TALE。另一類是非TALE效應因子。這類T3SEs結(jié)構(gòu)多變，功能多樣。XooPXO99A中，共有19個TALEs以及32個非TALE效應因子。在TALE類效應因子中，PthXo1、PthXo2和PthXo3的功能被研究得比較清晰[7?11]。在32個非TALE效應因子中，9個(XopK、XopP、 XopR、 XopY、 XopZ、XopN、XopF、XopV和XopAA)的功能已被研究，被認為參與PTI途徑(pathogen-associated molecular pattern triggered immunity)，抑制活性氧以及調(diào)控細胞壁參與的免疫響應等過程[12?13]，但是其中絕大多數(shù)的分子機制仍然不清楚[14]。因此，本實驗研究了轉(zhuǎn)錄因子HrpG，HrpX調(diào)控效應因子XopAY的表達情況和xopAY缺失對Xoo致病力的影響，旨在為水稻白葉枯病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料XopAY蛋白序列下載于NCBI，PXO99A為本實驗室保存；化學試劑購自廣州化學試劑公司和Sigma-Aldrich；PCR試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成；限制性內(nèi)切酶及高保真酶購自NEB China。本實驗的引物見表1，所用菌株和質(zhì)粒見表2。

表1 實驗引物Tab. 1 Primer sequences

表2 實驗菌株和質(zhì)粒Tab. 2 Bacterial strains and plasmids

1.2 基因敲除及致病力分析缺失突變體構(gòu)建及Xoo致病力參照以前發(fā)表的方法[15]。PCR擴增xopAY上下游各約500 bp片段，上下游片段分別用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/EcoRⅠ酶切回收后連接HindⅢ/EcoRⅠ酶切的pK18mobsacB，測序正確后通過電擊法轉(zhuǎn)入PXO99A中，兩步交換后通過PCR驗證獲得相應突變體。Xoo菌株致病力分析采用剪葉法，水稻為60 d IR24苗，每個菌株接種10片葉，14 d后觀察發(fā)病情況并量病斑長度。

1.3 互補菌株的構(gòu)建PCR擴增全長xopAY，通過無縫克隆的方式連接到pHM1載體（HindⅢ/EcoRⅠ酶切）上，測序正確后電擊轉(zhuǎn)化?xopAY，利用壯觀霉素篩選轉(zhuǎn)化子，PCR分析是否轉(zhuǎn)化成功[16]。

1.4 RNA提取及RT-qPCR分析PXO99A、?hrpG、?hrpX接種于PSA培養(yǎng)基中（w=1%牛肉膏，w=1%酵母提取物，w=1%蔗糖）中，28 ℃培養(yǎng)18 h后，離心收集菌體，將培養(yǎng)基換成Ⅲ型分泌系統(tǒng)誘導型培養(yǎng)基XOM2（0.18% Xylose，670 mmol·L?1Mothionine，10 mmol·L?1sodium glutamate，14.7 mmol·L?1KH2PO4，40 μmol·L?1MnSO4，240 μmol·L?1Fe(Ⅲ)-EDTA，5 mmol·L?1MgCl2，pH6.5），在28 ℃培養(yǎng)箱中誘導培養(yǎng)5 h，離心收集菌體，液氮速凍后進行RNA提取。RNA提取采用TIANGEN公司RNAprep pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取盒，提取方法參照試劑盒說明書提取。反轉(zhuǎn)錄采用Thermo公司的maxima H minus First Strand cDNA synthnesis Ki。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行RT-qPCR和RT-PCR。qPCR試劑用Vazyme公司的ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix。以gyrB基因為內(nèi)參。qPCR引物見表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析及作圖接種數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5作圖，圖像后期處理用Adobe Photoshop 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 XopAY的生物信息學分析植物病原菌T3SEs大多受轉(zhuǎn)錄因子HrpG和HrpX調(diào)控。HrpG激活hrpX的轉(zhuǎn)錄，HrpX結(jié)合到植物誘導啟動子盒（plant inducible promoter，PIP-box）上促進相關基因轉(zhuǎn)錄。HrpX結(jié)合的保守序列特征是：TTCGB-N(15)-TTCGB-N(30-32)-YANNRT (B代表C、G、T；Y代表C、T；R代表A、G、T)。通過分析發(fā)現(xiàn)，xopAY啟動子區(qū)域有1個保守的PIP-box及HrpX結(jié)合位點（圖1-A），暗示xopAY可能是T3SEs。

圖1 XopAY為預測的T3SEFig. 1 XopAY is a putative T3SE

T3SEs蛋白通常由2部分組成：N端分泌轉(zhuǎn)運信號區(qū)（在前50氨基酸內(nèi)）和C端功能區(qū)域。在XopAY的蛋白序列中，N?端第3個氨基酸序列為P氨酸，且脯氨酸和絲氨酸占N?端前50個氨基酸的百分比為18%，N?端前12位沒有天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）（圖1-B），這些符合Ⅲ型效應蛋白的特征[3,17]。此外，XopAY不含有轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)域。以上分析說明，XopAY應該為典型的非TALE類T3SE。

2.2 xopAY的表達受HrpG和HrpX調(diào)控由于xopAY啟動子含有保守的PIP-box，為此推測其表達受HrpG和HrpX調(diào)控。因此，筆者分析了野生型、hrpG和hrpX突變體中xopAY的表達情況。RT-qPCR)和反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）結(jié)果顯示，突變hrpG和hrpX均導致xopAY表達量急劇降低（圖2A），xopAY在野生型中的表達量約是突變體ΔhrpG和ΔhrpX中的5倍，且RT-PCR的結(jié)果顯示，xopAY在ΔhrpG和ΔhrpX的PCR條帶相對在野生型中暗淡和微弱（圖2B）。說明XopAY在Xoo中的表達受HrpG和HrpX正調(diào)控[18]。

圖2 HrpG和HrpX正調(diào)控xopAY的表達Fig. 2 xopAY expression is positively regulated by HrpG and HrpX

2.3 XopAY調(diào)控Xoo與水稻的互作上述實驗說明XopAY為T3SE。通常T3SE通過調(diào)控宿主細胞功能來影響病原菌與宿主的互作，因此，筆者檢測了xopAY突變對XooPXO99A致病力的影響。如圖3A所示，接種后病斑長度越長代表致病力越強，與野生型PXO99A相比，xopAY缺失突變體致病力顯著下降。通過互補分析發(fā)現(xiàn)，反式導入xopAY可以恢復ΔxopAY的致病力到野生型水平（圖3B）。實驗結(jié)果表明，XopAY對Xoo侵染水稻非常重要。

圖3 XopAY參與Xoo與水稻的互作Fig. 3 Pathogenicity analysis of PXO99A, ΔxopAY, and C-ΔxopAY

3 討 論

本研究通過生物信息學預測了XopAY作為Xoo候選效應因蛋白，通過構(gòu)建xopAY的缺失突變體以及回補菌株對水稻葉片進行接種，發(fā)現(xiàn)XopAY在Xoo侵染水稻的過程中起到至關重要的作用，在缺失xopAY的情況下，Xoo的致病能力顯著下降。本實驗結(jié)果驗證了xopAY受T3SS的重要調(diào)控因子HrpG和HrpX的調(diào)控。這些結(jié)果表明，XoPAY對Xoo的成功侵染起重要作用。雖然在不同病原菌中有很多效應因子被報道參與其致病過程，且機制清晰[12?17]，但XoPAY蛋白鮮見報道，說明其為新型效應因子，具體功能尚不清楚。此外，XopAY通過干預水稻細胞的何種信號或代謝途徑進而影響病原菌的致病力仍然未知。今后還有侍鑒定XopAY的生化活性，分析其影響植物細胞功能的方式、途徑及調(diào)控機制，以便進一步解析Xoo與水稻的互作機制。