費小雯，張 陽，李亞軍，鄧曉東

（1. 海南醫(yī)學院 基礎醫(yī)學與生命科學學院，?？?571101; 2. 中國熱帶農業(yè)科學院 熱帶生物技術研究所/海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，?？?571101）

蚊子是登革熱、登革出血熱、瘧疾、基孔肯雅熱、寨卡熱、西尼羅河熱、流行性乙型腦炎和黃熱病等可怕疾病的媒介。2015年，僅瘧疾就在全球造成了43.8萬人死亡；登革熱也是一種可怕的由蚊子傳播的疾病，每年在全世界造成2萬多人死亡；由于氣候變化、全球化和病毒進化，登革熱和其他蚊媒疾病的發(fā)病率每年都在上升。中國疾病預防控制中心統(tǒng)計結果表明，2000—2011年，我國登革熱發(fā)病較多的省份是廣東、海南和福建，就全國范圍而言，登革熱發(fā)病率不高；2011年后登革熱發(fā)病率迅速上升，2014年出現(xiàn)大爆發(fā)，發(fā)病人數(shù)達到46 864例；2015—2018年的發(fā)病率呈平穩(wěn)波動[1]，2019年又出現(xiàn)明顯上升，發(fā)病人數(shù)達到22 599例，是近20年來的第二個發(fā)病高峰[2]。由于迄今尚無有效的藥物能治療登革熱，也沒有安全有效的疫苗，因此，多數(shù)國家釆用控制登革熱傳播媒介的方法來進行登革熱的防治。在我國，登革熱主要以白紋伊蚊（Aedes albopictus）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）為傳播媒介。目前對于這2種蚊蟲的防控，主要采用殺蟲劑。殺蟲劑的使用，一方面會對環(huán)境造成不可逆的污染，另一方面，蚊蟲對化學藥劑的耐受性也在不斷增加。因此，迫切需要一種對環(huán)境友好的技術來控制埃及伊蚊和白紋伊蚊。RNAi是由小分子RNA引起目標基因表達沉默的現(xiàn)象，在農業(yè)上，被廣泛用以沉默害蟲發(fā)育關鍵基因，以達到防治農業(yè)害蟲的目的。飼喂產生RNAi效應的整個過程包括取食、dsRNA從中腸內壁細胞吸收進入中腸細胞（環(huán)境RNAi效應）穿越過中腸向其他組織擴散傳遞（系統(tǒng)RNAi效應）。

蚊幼蟲一般以水體中綠藻門中個體較小的微藻為食物，如衣藻、小球藻、柵藻、團藻等。在動物體內，色氨酸代謝的主要途徑是：色氨酸分解產生犬尿氨酸（Kynurenine，KYN），KYN繼續(xù)分解代謝產生3-羥基犬尿氨酸（3-HK）[3]。3-HK在動物體內參與氧化應激反應，會立刻氧化生成大量的活性氧，具有神經毒性。體外實驗結果表明，向紅尾糞麻蠅注射1 μmol·L?1的3-HK可以致使其神經麻痹而死亡。羥基犬尿氨酸轉氨酶（3-hydroxykynurenine transaminase，3HKT））可以催化3-HK產生無毒中間體黃尿烯酸，具有解毒的作用[4]，所以如果將3HKT基因沉默，可能導致伊蚊的死亡。在利用微藻控制媒介昆蟲方面，KUMAR等[5]利用按蚊3HKT RNAi轉基因衣藻控制岡比亞按蚊（Anopheles gambiae），取得一定效果。本研究設計針對伊蚊3HKT基因的RNAi序列片段，克隆、連接到中間載體T282上，得到反向重復序列，最終連接到衣藻特異的RNAi表達載體pMaa7IR/XIR上。將含有3HKT基因反向重復序列的RNAi表達載體通過玻璃珠法分別轉化衣藻，利用巴龍霉素的選擇和酶切鑒定最終得到含有目的基因反向重復序列的工程藻株。將上述得到的轉基因工程藻株，喂養(yǎng)埃及伊蚊幼蟲，觀察統(tǒng)計幼蟲的生長、發(fā)育、死亡數(shù)據(jù)。本研究旨在為生物殺蚊，阻斷登革熱、寨卡病毒病等惡性傳染病的流行提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料萊茵衣藻（Chlamydomonas reinharditiiCC425）為細胞壁缺失的藻株，購自中國科學院淡水藻種庫。藻株接種在TAP固體培養(yǎng)基上和TAP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，搖床轉速220 r·min?1，光照強度為110 μmol·m?2·s?1，24 h全天光照。RNAi干涉載體ppMaa7IR/XIR、中間載體T282由本實驗室保存。其他試劑盒轉化菌株購自上海生工生物工程有限公司、大連寶生物有限公司等。

1.2 萊茵衣藻RNA提取和cDNA制備萊茵衣藻CC425在110 μmol·（m?2·s?1）、25 ℃、24 h全天光照條件下培養(yǎng)，待藻株生長到對數(shù)生長中期，收集100 mL藻液，12 000 r·min?1離心3 min，去上清液，取底部藻體，液氮速凍。利用大連寶生物Trizol植物RNA提取試劑盒抽提衣藻總RNA，并利用大連寶生物公司cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA待用[6]。

1.3 3HKT RNAi 載體的構建根據(jù)genebank上公布的埃及伊蚊3HKT 部分編碼區(qū)序列，通過上海生工生物有限公司合成430 bp序列。產物連接到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，以上海生工工程有限公司質粒小量試劑盒提取質粒，隨后進行酶切分析，得到載體pMD-3HKT。以HindⅢ和BamH Ⅰ分別酶切質粒T282和pMD-3HKT，回收3HKT正向片段，與T282連接，轉化大腸桿菌，以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鑒定重組質粒。以SalⅠ和XbaⅠ酶切上述重組質粒，并與反向3HKT片段連接，轉化大腸桿菌，SalⅠ和XbaⅠ酶切鑒定，得到含3HKT回文序列的中間載體，并克隆進pMaa7IR/XIR中，得到干涉載體pMaa7IR/3HKTIR。

1.4 萊茵衣藻遺傳轉化將1 μg重組質粒pMaa7IR/3HKT IR、500 μL藻液、50 μL PEG8000、400 mg玻璃珠在渦旋振蕩器上振蕩共混30 s。將混合液體轉移到10 mL離心管，溫培養(yǎng)12 h，然后將細胞均勻涂布在添加色氨酸和巴龍霉素的TAP培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～6 d，待藻落長出后，進行后續(xù)檢測和伊蚊的喂食實驗[7]。

1.5 伊蚊飼養(yǎng)和生物學檢測在溫度26 ℃濕度75%的培養(yǎng)箱內將清水加入大培養(yǎng)皿中，添加少量飼料，將產有蚊卵的濾紙放置水中，光照2 h后，就可以觀察到孵化的幼蟲。幼蟲成蛹后，將蛹吸出放入伊蚊成蚊飼養(yǎng)籠中，待成蚊羽化后以蔗糖水喂食成蚊。將Maa7IR/3HKT IR轉基因工程藻株在50 mL TAP培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長中期，每天取出5 mL喂食伊蚊幼蟲。記錄幼蟲的長度、存活數(shù)量等。

2 結果與分析

2.1 3HKT RNA表達載體pMaa7 IR/3HKTIR的構建本實驗的埃及伊蚊3HKT基因全長1 167 bp（GenBank登錄號：XM_021849682, 蛋白EAT45177.1, AAEL003508-PA），其開放閱讀框為1 203 bp，編碼400個氨基酸殘基，5′端非編碼區(qū)長度為455 bp，3′端非編碼區(qū)長度為143 bp。3HKT含有AGAT（丙氨酸乙醛轉氨酶）家族保守區(qū)序列。聚類分析顯示[8?9]：埃及伊蚊3HKT與白紋伊蚊（Aedes albopictus）、致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）、達氏按蚊（Anopheles darlingi）3HKT遺傳距離較近，其次是果蠅，距離較遠的是螢火蟲（Photinus pyralis）和扁螢蟲（Lamprigera yunnana）（圖1）。

圖1 埃及伊蚊3HKT蛋白與其他生物中的同源基因聚類分析Fig. 1 Evolutionary relationship of V-ATPA gene in Aedes aegypti and the orthologous

3HKT RNAi正向和反向片段的獲得：根據(jù)GenBank上埃及伊蚊3HKT部分編碼區(qū)序列通過上海生工生物有限公司合成干涉片段，克隆進pMD18-T后，得到pMD-3HKT。測序結果表明，克隆的3HKT基因片段與埃及伊蚊3HKT基因（GenBank序列號: XM_021849682）序列同源性為100%。通過HindⅢ、BamHⅠ雙酶切，將此469 bp 3HKT基因正向片段從質粒pMD-3HKT上切下來，得到3HKT基因正向片段。同樣以SalⅠ、XbaⅠ將反向片段從pMD-3HKT切下來（圖2-A，B）。將正向片段與質粒T282連接，獲得重組質粒。在此基礎上連接反向片段，得到含有正向和反向重復片段約1 200 bp的中間載體T282-3HKT （圖2-C）。在此基礎上，將中間載體T282-3HKT中約1 100 bp的重復序列克隆進pMaa7 IR/XIR，得到RNA表達載體pMaa7 IR/3HKTIR （圖2-D）。

圖2 RNA表達載體pMaa7 IR/3HKTIR構建Fig. 2 The construction of pMaa7 IR/3HKTIR

2.2 3HKT RNAi表達載體轉化萊茵衣藻pMaa7IR/3HKTIR RNAi表達載體轉化萊茵衣藻后，轉基因藻株涂布于抗性TAP培養(yǎng)基平板上進行篩選，共得到85株3HKT RNAi轉基因藻株。提取轉基因藻株DNA，并對轉基因藻株進行PCR擴增，鑒定是否含有插入片段，結果（圖3）表明，85株3HKT RNAi轉化藻株中36株呈陽性。

圖3 轉基因藻株PCR檢測結果Fig. 3 PCR results of transgenic algae strains

2.3 飼喂轉基因藻株的伊蚊檢測對照組幼蟲喂食飼料（鼠糧）、清水、非轉基因衣藻CC425、轉pMaa7IR/XIR衣藻；處理組幼蟲喂食轉pMaa7IR/3HKTIR 衣藻（每組10只幼蟲，重復3次試驗），化蛹后移入蚊籠，以10%糖水喂養(yǎng)成蚊（圖4）。在相同喂食條件下，與喂食飼料、清水、非轉基因衣藻CC425、轉pMaa7IR/XIR載體衣藻（Maa7）對照組相比，喂食轉pMaa7IR/3HKTIR衣藻藻株3HKT-1、3HKT-2、3HKT-5、3HKT-6、3HKT-8、3HKT-11、3HKT-16、3HKT-19的伊蚊幼蟲在第2天開始有幼蟲死亡。死亡率分別是（30±2）%，（80±5）%，（90±4）%，100%，（80±3）%，（80±3）%，（40±2）%，（70±3）%。喂食飼料、清水、非轉基因藻株CC425和轉空白載體pMaa7IR/XIR藻株的死亡率為0%。喂食轉基因藻株完全死亡的時間分別是：3HKT-1 第3天，3HKT-2第5天，3HKT-5第4天，3HKT-6第2天，3HKT-8第4天，3HKT-11第7天，3HKT-16第57天，3HKT-19第4天。喂食轉空白載體pMaa7IR/XIR的藻株Maa7-2的死亡率為（20±2）%（表1）。結果表明，3HKT RNAi轉基因藻株對伊蚊有較強的致死作用。

表1 喂食pMaa7IR/3HKTIR 轉基因藻株伊蚊的死亡率Tab. 1 Mortality rate of Aedes aegypti fed with the pMaa7IR / 3HKTIR transgenic algae strain

圖4 轉基因藻株喂食埃及伊蚊Fig. 4 Transgenic algae strains used to feed Aedes aegypti

2.4 飼喂pMaa7IR/3HKTIR轉基因工程藻后體內3HKT基因的表達為了檢測埃及伊蚊在喂食轉基因工程藻后其體內3HKT基因表達是否降低，在相同的飼養(yǎng)條件下，在幼蟲孵育的第4天，以飼喂萊茵衣藻CC425伊蚊為對照，檢測飼喂pMaa7IR/3HKTIR轉基因工程藻株伊蚊幼蟲3HKT表達變化情況。Real time PCR檢測結果（圖5）表明，飼喂pMaa7IR/3HKTIR轉基因工程藻株（3HKT-1、3HKT-2、3HKT-5、3HKT-6、3HKT-8、3HKT-11、3HKT-16、3HKT-19）伊蚊幼蟲和飼喂CC425對照相比，它們的3HKT基因表達量有很明顯的降低。飼喂3HKT-5伊蚊表達量下降最多，與對照相比下降了99.25%；其次是飼喂3HKT-19和3HKT-6伊蚊，它們的RNA表達量較對照分別下降98.66%和98.64%。結果表明，實驗所選取的工程藻株均能有效沉默伊蚊體內的3HKT基因。

圖5 飼喂pMaa7IR/3HKTIR轉基因藻4 d后埃及伊蚊幼蟲的相對mRNA水平Fig. 5 Relative mRNA levels of Aedes aegypti larvae after fed with the pMaa7IR/3HKTIR transgenic algae for 4 days

3 討 論

近年來，蚊媒傳病嚴重危害全世界人類的生命健康，成為巨大的公共衛(wèi)生危害，其中，伊蚊在疾病傳播扮演中起十分重要的作用，例如寨卡病毒病、登革熱、基孔肯雅病、黃熱病等都是由伊蚊傳播的。因此，需要一種有效的手段來防控伊蚊，從而達到控制疾病傳播的目的。

化學殺蟲劑為目前蚊蟲控制的主要工具，但是，對化學殺蟲劑的嚴重依賴又造成了很多問題，如蚊蟲抗藥性問題、殺蟲劑對環(huán)境和人類健康造成的影響。RNAi干涉是近年生化分子生物學領域引入的一種防治害蟲的新手段。昆蟲具有運行RNAi機制的基本成分，在不同的昆蟲組目中有許多成功的RNAi實例[10]。由于RNAi能夠下調昆蟲的靶基因，因此提出了將其作為控制昆蟲種群的新工具[11?12]。在蚊蟲研究方面，RNAi已被廣泛應用于蚊子基因功能和蚊子與病原體相互作用的研究[13]。在利用RNAi干涉防治蚊蟲方面，目前主要采用注射、浸泡、納米顆粒和微生物等幾種方法將dsRNA傳遞到蚊子幼蟲中[13?15]。RNAi分子（dsRNA、miRNA、shRNA）可以通過浸泡、注射、納米顆粒包裹或滲透處理（脫水化和再水化）進入蚊子幼蟲細胞[16?22]。另一方面，利用微生物（細菌、酵母、藻類）傳遞dsRNA、miRNA、shRNA也有成功案例[5，23?24]；Kumar等[5]利用按蚊3HKT RNAi轉基因衣藻控制岡比亞按蚊（Anopheles gambiae），轉基因藻株致死率平均為33%左右，最高致死率為53%；本研究轉基因藻株對伊蚊的致死率為100%。產生不同效果的原因主要是針對的物種差異，以及選取的RNAi沉默片段的差異。

本研究通過向埃及伊蚊幼蟲天然食物衣藻轉化伊蚊3HKT RNAi表達載體，結果表明，pMaa7IR/3HKTIR轉基因藻株對伊蚊幼蟲的成活率、化蛹時間和數(shù)量、成蟲羽化時間和數(shù)量均存在較大的影響。3HKT RNAi轉基因藻株對伊蚊有一定的致死作用。由于微藻是蚊子幼蟲天然食物，在自然界廣泛存在。目前，小球藻、螺旋藻、衣藻等綠藻門微藻均可進行工廠化大規(guī)模生產，相對于轉基因伊蚊和沃爾巴克氏體細菌感染伊蚊，生產成本低廉、技術成熟，可以長期大規(guī)模投放在封閉區(qū)域，形成優(yōu)勢藻種，逐步消除該地區(qū)的伊蚊，為生物殺蟲阻斷登革熱、寨卡病毒病、黃熱病等惡性傳染病的流行提供新的思路。