費(fèi)小雯，張 陽(yáng)，李亞軍，鄧曉東

（1. 海南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，?？?571101; 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所/海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101）

蚊子是登革熱、登革出血熱、瘧疾、基孔肯雅熱、寨卡熱、西尼羅河熱、流行性乙型腦炎和黃熱病等可怕疾病的媒介。2015年，僅瘧疾就在全球造成了43.8萬(wàn)人死亡；登革熱也是一種可怕的由蚊子傳播的疾病，每年在全世界造成2萬(wàn)多人死亡；由于氣候變化、全球化和病毒進(jìn)化，登革熱和其他蚊媒疾病的發(fā)病率每年都在上升。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，2000—2011年，我國(guó)登革熱發(fā)病較多的省份是廣東、海南和福建，就全國(guó)范圍而言，登革熱發(fā)病率不高；2011年后登革熱發(fā)病率迅速上升，2014年出現(xiàn)大爆發(fā)，發(fā)病人數(shù)達(dá)到46 864例；2015—2018年的發(fā)病率呈平穩(wěn)波動(dòng)[1]，2019年又出現(xiàn)明顯上升，發(fā)病人數(shù)達(dá)到22 599例，是近20年來(lái)的第二個(gè)發(fā)病高峰[2]。由于迄今尚無(wú)有效的藥物能治療登革熱，也沒(méi)有安全有效的疫苗，因此，多數(shù)國(guó)家釆用控制登革熱傳播媒介的方法來(lái)進(jìn)行登革熱的防治。在我國(guó)，登革熱主要以白紋伊蚊（Aedes albopictus）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）為傳播媒介。目前對(duì)于這2種蚊蟲(chóng)的防控，主要采用殺蟲(chóng)劑。殺蟲(chóng)劑的使用，一方面會(huì)對(duì)環(huán)境造成不可逆的污染，另一方面，蚊蟲(chóng)對(duì)化學(xué)藥劑的耐受性也在不斷增加。因此，迫切需要一種對(duì)環(huán)境友好的技術(shù)來(lái)控制埃及伊蚊和白紋伊蚊。RNAi是由小分子RNA引起目標(biāo)基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，在農(nóng)業(yè)上，被廣泛用以沉默害蟲(chóng)發(fā)育關(guān)鍵基因，以達(dá)到防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的目的。飼喂產(chǎn)生RNAi效應(yīng)的整個(gè)過(guò)程包括取食、dsRNA從中腸內(nèi)壁細(xì)胞吸收進(jìn)入中腸細(xì)胞（環(huán)境RNAi效應(yīng)）穿越過(guò)中腸向其他組織擴(kuò)散傳遞（系統(tǒng)RNAi效應(yīng)）。

蚊幼蟲(chóng)一般以水體中綠藻門(mén)中個(gè)體較小的微藻為食物，如衣藻、小球藻、柵藻、團(tuán)藻等。在動(dòng)物體內(nèi)，色氨酸代謝的主要途徑是：色氨酸分解產(chǎn)生犬尿氨酸（Kynurenine，KYN），KYN繼續(xù)分解代謝產(chǎn)生3-羥基犬尿氨酸（3-HK）[3]。3-HK在動(dòng)物體內(nèi)參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)立刻氧化生成大量的活性氧，具有神經(jīng)毒性。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，向紅尾糞麻蠅注射1 μmol·L?1的3-HK可以致使其神經(jīng)麻痹而死亡。羥基犬尿氨酸轉(zhuǎn)氨酶（3-hydroxykynurenine transaminase，3HKT））可以催化3-HK產(chǎn)生無(wú)毒中間體黃尿烯酸，具有解毒的作用[4]，所以如果將3HKT基因沉默，可能導(dǎo)致伊蚊的死亡。在利用微藻控制媒介昆蟲(chóng)方面，KUMAR等[5]利用按蚊3HKT RNAi轉(zhuǎn)基因衣藻控制岡比亞按蚊（Anopheles gambiae），取得一定效果。本研究設(shè)計(jì)針對(duì)伊蚊3HKT基因的RNAi序列片段，克隆、連接到中間載體T282上，得到反向重復(fù)序列，最終連接到衣藻特異的RNAi表達(dá)載體pMaa7IR/XIR上。將含有3HKT基因反向重復(fù)序列的RNAi表達(dá)載體通過(guò)玻璃珠法分別轉(zhuǎn)化衣藻，利用巴龍霉素的選擇和酶切鑒定最終得到含有目的基因反向重復(fù)序列的工程藻株。將上述得到的轉(zhuǎn)基因工程藻株，喂養(yǎng)埃及伊蚊幼蟲(chóng)，觀察統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、死亡數(shù)據(jù)。本研究旨在為生物殺蚊，阻斷登革熱、寨卡病毒病等惡性傳染病的流行提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料萊茵衣藻（Chlamydomonas reinharditiiCC425）為細(xì)胞壁缺失的藻株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)。藻株接種在TAP固體培養(yǎng)基上和TAP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速220 r·min?1，光照強(qiáng)度為110 μmol·m?2·s?1，24 h全天光照。RNAi干涉載體ppMaa7IR/XIR、中間載體T282由本實(shí)驗(yàn)室保存。其他試劑盒轉(zhuǎn)化菌株購(gòu)自上海生工生物工程有限公司、大連寶生物有限公司等。

1.2 萊茵衣藻RNA提取和cDNA制備萊茵衣藻CC425在110 μmol·（m?2·s?1）、25 ℃、24 h全天光照條件下培養(yǎng)，待藻株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，收集100 mL藻液，12 000 r·min?1離心3 min，去上清液，取底部藻體，液氮速凍。利用大連寶生物Trizol植物RNA提取試劑盒抽提衣藻總RNA，并利用大連寶生物公司cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA待用[6]。

1.3 3HKT RNAi 載體的構(gòu)建根據(jù)genebank上公布的埃及伊蚊3HKT 部分編碼區(qū)序列，通過(guò)上海生工生物有限公司合成430 bp序列。產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，以上海生工工程有限公司質(zhì)粒小量試劑盒提取質(zhì)粒，隨后進(jìn)行酶切分析，得到載體pMD-3HKT。以HindⅢ和BamH Ⅰ分別酶切質(zhì)粒T282和pMD-3HKT，回收3HKT正向片段，與T282連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鑒定重組質(zhì)粒。以SalⅠ和XbaⅠ酶切上述重組質(zhì)粒，并與反向3HKT片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，SalⅠ和XbaⅠ酶切鑒定，得到含3HKT回文序列的中間載體，并克隆進(jìn)pMaa7IR/XIR中，得到干涉載體pMaa7IR/3HKTIR。

1.4 萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化將1 μg重組質(zhì)粒pMaa7IR/3HKT IR、500 μL藻液、50 μL PEG8000、400 mg玻璃珠在渦旋振蕩器上振蕩共混30 s。將混合液體轉(zhuǎn)移到10 mL離心管，溫培養(yǎng)12 h，然后將細(xì)胞均勻涂布在添加色氨酸和巴龍霉素的TAP培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～6 d，待藻落長(zhǎng)出后，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)和伊蚊的喂食實(shí)驗(yàn)[7]。

1.5 伊蚊飼養(yǎng)和生物學(xué)檢測(cè)在溫度26 ℃濕度75%的培養(yǎng)箱內(nèi)將清水加入大培養(yǎng)皿中，添加少量飼料，將產(chǎn)有蚊卵的濾紙放置水中，光照2 h后，就可以觀察到孵化的幼蟲(chóng)。幼蟲(chóng)成蛹后，將蛹吸出放入伊蚊成蚊飼養(yǎng)籠中，待成蚊羽化后以蔗糖水喂食成蚊。將Maa7IR/3HKT IR轉(zhuǎn)基因工程藻株在50 mL TAP培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，每天取出5 mL喂食伊蚊幼蟲(chóng)。記錄幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度、存活數(shù)量等。

2 結(jié)果與分析

2.1 3HKT RNA表達(dá)載體pMaa7 IR/3HKTIR的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)的埃及伊蚊3HKT基因全長(zhǎng)1 167 bp（GenBank登錄號(hào)：XM_021849682, 蛋白EAT45177.1, AAEL003508-PA），其開(kāi)放閱讀框?yàn)? 203 bp，編碼400個(gè)氨基酸殘基，5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為455 bp，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為143 bp。3HKT含有AGAT（丙氨酸乙醛轉(zhuǎn)氨酶）家族保守區(qū)序列。聚類(lèi)分析顯示[8?9]：埃及伊蚊3HKT與白紋伊蚊（Aedes albopictus）、致倦庫(kù)蚊（Culex quinquefasciatus）、達(dá)氏按蚊（Anopheles darlingi）3HKT遺傳距離較近，其次是果蠅，距離較遠(yuǎn)的是螢火蟲(chóng)（Photinus pyralis）和扁螢蟲(chóng)（Lamprigera yunnana）（圖1）。

圖1 埃及伊蚊3HKT蛋白與其他生物中的同源基因聚類(lèi)分析Fig. 1 Evolutionary relationship of V-ATPA gene in Aedes aegypti and the orthologous

3HKT RNAi正向和反向片段的獲得：根據(jù)GenBank上埃及伊蚊3HKT部分編碼區(qū)序列通過(guò)上海生工生物有限公司合成干涉片段，克隆進(jìn)pMD18-T后，得到pMD-3HKT。測(cè)序結(jié)果表明，克隆的3HKT基因片段與埃及伊蚊3HKT基因（GenBank序列號(hào): XM_021849682）序列同源性為100%。通過(guò)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切，將此469 bp 3HKT基因正向片段從質(zhì)粒pMD-3HKT上切下來(lái)，得到3HKT基因正向片段。同樣以SalⅠ、XbaⅠ將反向片段從pMD-3HKT切下來(lái)（圖2-A，B）。將正向片段與質(zhì)粒T282連接，獲得重組質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上連接反向片段，得到含有正向和反向重復(fù)片段約1 200 bp的中間載體T282-3HKT （圖2-C）。在此基礎(chǔ)上，將中間載體T282-3HKT中約1 100 bp的重復(fù)序列克隆進(jìn)pMaa7 IR/XIR，得到RNA表達(dá)載體pMaa7 IR/3HKTIR （圖2-D）。

圖2 RNA表達(dá)載體pMaa7 IR/3HKTIR構(gòu)建Fig. 2 The construction of pMaa7 IR/3HKTIR

2.2 3HKT RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化萊茵衣藻pMaa7IR/3HKTIR RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化萊茵衣藻后，轉(zhuǎn)基因藻株涂布于抗性TAP培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，共得到85株3HKT RNAi轉(zhuǎn)基因藻株。提取轉(zhuǎn)基因藻株DNA，并對(duì)轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定是否含有插入片段，結(jié)果（圖3）表明，85株3HKT RNAi轉(zhuǎn)化藻株中36株呈陽(yáng)性。

圖3 轉(zhuǎn)基因藻株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 PCR results of transgenic algae strains

2.3 飼喂轉(zhuǎn)基因藻株的伊蚊檢測(cè)對(duì)照組幼蟲(chóng)喂食飼料（鼠糧）、清水、非轉(zhuǎn)基因衣藻CC425、轉(zhuǎn)pMaa7IR/XIR衣藻；處理組幼蟲(chóng)喂食轉(zhuǎn)pMaa7IR/3HKTIR 衣藻（每組10只幼蟲(chóng)，重復(fù)3次試驗(yàn)），化蛹后移入蚊籠，以10%糖水喂養(yǎng)成蚊（圖4）。在相同喂食條件下，與喂食飼料、清水、非轉(zhuǎn)基因衣藻CC425、轉(zhuǎn)pMaa7IR/XIR載體衣藻（Maa7）對(duì)照組相比，喂食轉(zhuǎn)pMaa7IR/3HKTIR衣藻藻株3HKT-1、3HKT-2、3HKT-5、3HKT-6、3HKT-8、3HKT-11、3HKT-16、3HKT-19的伊蚊幼蟲(chóng)在第2天開(kāi)始有幼蟲(chóng)死亡。死亡率分別是（30±2）%，（80±5）%，（90±4）%，100%，（80±3）%，（80±3）%，（40±2）%，（70±3）%。喂食飼料、清水、非轉(zhuǎn)基因藻株CC425和轉(zhuǎn)空白載體pMaa7IR/XIR藻株的死亡率為0%。喂食轉(zhuǎn)基因藻株完全死亡的時(shí)間分別是：3HKT-1 第3天，3HKT-2第5天，3HKT-5第4天，3HKT-6第2天，3HKT-8第4天，3HKT-11第7天，3HKT-16第57天，3HKT-19第4天。喂食轉(zhuǎn)空白載體pMaa7IR/XIR的藻株Maa7-2的死亡率為（20±2）%（表1）。結(jié)果表明，3HKT RNAi轉(zhuǎn)基因藻株對(duì)伊蚊有較強(qiáng)的致死作用。

表1 喂食pMaa7IR/3HKTIR 轉(zhuǎn)基因藻株伊蚊的死亡率Tab. 1 Mortality rate of Aedes aegypti fed with the pMaa7IR / 3HKTIR transgenic algae strain

圖4 轉(zhuǎn)基因藻株喂食埃及伊蚊Fig. 4 Transgenic algae strains used to feed Aedes aegypti

2.4 飼喂pMaa7IR/3HKTIR轉(zhuǎn)基因工程藻后體內(nèi)3HKT基因的表達(dá)為了檢測(cè)埃及伊蚊在喂食轉(zhuǎn)基因工程藻后其體內(nèi)3HKT基因表達(dá)是否降低，在相同的飼養(yǎng)條件下，在幼蟲(chóng)孵育的第4天，以飼喂萊茵衣藻CC425伊蚊為對(duì)照，檢測(cè)飼喂pMaa7IR/3HKTIR轉(zhuǎn)基因工程藻株伊蚊幼蟲(chóng)3HKT表達(dá)變化情況。Real time PCR檢測(cè)結(jié)果（圖5）表明，飼喂pMaa7IR/3HKTIR轉(zhuǎn)基因工程藻株（3HKT-1、3HKT-2、3HKT-5、3HKT-6、3HKT-8、3HKT-11、3HKT-16、3HKT-19）伊蚊幼蟲(chóng)和飼喂CC425對(duì)照相比，它們的3HKT基因表達(dá)量有很明顯的降低。飼喂3HKT-5伊蚊表達(dá)量下降最多，與對(duì)照相比下降了99.25%；其次是飼喂3HKT-19和3HKT-6伊蚊，它們的RNA表達(dá)量較對(duì)照分別下降98.66%和98.64%。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)所選取的工程藻株均能有效沉默伊蚊體內(nèi)的3HKT基因。

圖5 飼喂pMaa7IR/3HKTIR轉(zhuǎn)基因藻4 d后埃及伊蚊幼蟲(chóng)的相對(duì)mRNA水平Fig. 5 Relative mRNA levels of Aedes aegypti larvae after fed with the pMaa7IR/3HKTIR transgenic algae for 4 days

3 討 論

近年來(lái)，蚊媒傳病嚴(yán)重危害全世界人類(lèi)的生命健康，成為巨大的公共衛(wèi)生危害，其中，伊蚊在疾病傳播扮演中起十分重要的作用，例如寨卡病毒病、登革熱、基孔肯雅病、黃熱病等都是由伊蚊傳播的。因此，需要一種有效的手段來(lái)防控伊蚊，從而達(dá)到控制疾病傳播的目的。

化學(xué)殺蟲(chóng)劑為目前蚊蟲(chóng)控制的主要工具，但是，對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的嚴(yán)重依賴(lài)又造成了很多問(wèn)題，如蚊蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題、殺蟲(chóng)劑對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康造成的影響。RNAi干涉是近年生化分子生物學(xué)領(lǐng)域引入的一種防治害蟲(chóng)的新手段。昆蟲(chóng)具有運(yùn)行RNAi機(jī)制的基本成分，在不同的昆蟲(chóng)組目中有許多成功的RNAi實(shí)例[10]。由于RNAi能夠下調(diào)昆蟲(chóng)的靶基因，因此提出了將其作為控制昆蟲(chóng)種群的新工具[11?12]。在蚊蟲(chóng)研究方面，RNAi已被廣泛應(yīng)用于蚊子基因功能和蚊子與病原體相互作用的研究[13]。在利用RNAi干涉防治蚊蟲(chóng)方面，目前主要采用注射、浸泡、納米顆粒和微生物等幾種方法將dsRNA傳遞到蚊子幼蟲(chóng)中[13?15]。RNAi分子（dsRNA、miRNA、shRNA）可以通過(guò)浸泡、注射、納米顆粒包裹或滲透處理（脫水化和再水化）進(jìn)入蚊子幼蟲(chóng)細(xì)胞[16?22]。另一方面，利用微生物（細(xì)菌、酵母、藻類(lèi)）傳遞dsRNA、miRNA、shRNA也有成功案例[5，23?24]；Kumar等[5]利用按蚊3HKT RNAi轉(zhuǎn)基因衣藻控制岡比亞按蚊（Anopheles gambiae），轉(zhuǎn)基因藻株致死率平均為33%左右，最高致死率為53%；本研究轉(zhuǎn)基因藻株對(duì)伊蚊的致死率為100%。產(chǎn)生不同效果的原因主要是針對(duì)的物種差異，以及選取的RNAi沉默片段的差異。

本研究通過(guò)向埃及伊蚊幼蟲(chóng)天然食物衣藻轉(zhuǎn)化伊蚊3HKT RNAi表達(dá)載體，結(jié)果表明，pMaa7IR/3HKTIR轉(zhuǎn)基因藻株對(duì)伊蚊幼蟲(chóng)的成活率、化蛹時(shí)間和數(shù)量、成蟲(chóng)羽化時(shí)間和數(shù)量均存在較大的影響。3HKT RNAi轉(zhuǎn)基因藻株對(duì)伊蚊有一定的致死作用。由于微藻是蚊子幼蟲(chóng)天然食物，在自然界廣泛存在。目前，小球藻、螺旋藻、衣藻等綠藻門(mén)微藻均可進(jìn)行工廠化大規(guī)模生產(chǎn)，相對(duì)于轉(zhuǎn)基因伊蚊和沃爾巴克氏體細(xì)菌感染伊蚊，生產(chǎn)成本低廉、技術(shù)成熟，可以長(zhǎng)期大規(guī)模投放在封閉區(qū)域，形成優(yōu)勢(shì)藻種，逐步消除該地區(qū)的伊蚊，為生物殺蟲(chóng)阻斷登革熱、寨卡病毒病、黃熱病等惡性傳染病的流行提供新的思路。