吳昌學(xué)，董艷軍，黃 赟，肖子宇，李 毅，齊曉嵐，官志忠，肖 雁

（1.地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州貴陽(yáng) 550004）

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是目前最常見(jiàn)的老年癡呆病之一，為缺血性、低灌注、出血性腦損傷等一系列心腦血管疾病導(dǎo)致的智能及認(rèn)知功能障礙綜合征，相較于阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性及臨床特點(diǎn)的不可逆性，其具有可逆性，故被稱(chēng)為“可逆性癡呆”[1]。主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能的缺失或損傷，同時(shí)伴有語(yǔ)言、運(yùn)動(dòng)、空間及人格等方面的問(wèn)題。硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）作為新型氣體信號(hào)分子，其在體內(nèi)主要以HS—形式存在。有學(xué)者的研究結(jié)果提示，H2S與神經(jīng)系統(tǒng)及心腦血管疾病相關(guān)，H2S能增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬的長(zhǎng)時(shí)程記憶及調(diào)控大腦細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度及pH水平[2-3]。雖然H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能的研究倍受關(guān)注，但是其對(duì)腦缺血的作用機(jī)制尚不明確。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）是一種低分化的腫瘤細(xì)胞，顯示中等水平的多巴胺-β-羥基酶活性，細(xì)胞形態(tài)、生理及生化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，有明顯的軸突。因其具有分化程度低、增殖快及形態(tài)穩(wěn)定等特點(diǎn)，常被用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究[4-5]。因此，本研究以氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后的SH-SY5Y細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞的體外缺血再灌注損傷模型，探討H2S對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器NaHS購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)），牛血清、DMEM培養(yǎng)基、2.5 mL/L胰蛋白酶液及10×PBS均購(gòu)自HyClone公司，二甲亞砜(DMSO)購(gòu)自Gibco公司。Tris堿、甘氨酸PMSF、SDS、Tween-20、RIPA裂解液（強(qiáng)）購(gòu)自碧云天生物有限公司。5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，顯影膠片購(gòu)自Amersham公司（美國(guó)），蛋白Marker購(gòu)自GeneTex公司，PVDF膜和ECL試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Annexin V-FITC/PI）購(gòu)自上海貝博生物公司，anti-β-actin、GRP78、CHOP一抗購(gòu)自Abcam公司（美國(guó)），anti-NFκBp65、COX一抗購(gòu)自CST公司（美國(guó)），通用二抗購(gòu)自Abmart公司。流式細(xì) 胞儀(美國(guó)BD公司)，ELX 800 UV酶 標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tec公 司)，Western blotting跑 膠裝置(北京百晶生物技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用SH-SY5Y細(xì)胞株，為本課題組穩(wěn)定保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[6]，常規(guī)培養(yǎng)方法復(fù)蘇細(xì)胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 mL/L胎牛血清）稀釋細(xì)胞后置37℃、50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2~3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.2.2OGD/R模型的制備使用課題組的常用方法[6]建立OGD/R模型：根據(jù)前期課題組氧糖剝奪各個(gè)時(shí)間的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選取氧糖剝奪12 h再恢復(fù)正常培養(yǎng)24 h來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化分離，計(jì)數(shù)細(xì)胞后制成密度為1×108/L的細(xì)胞懸液，按接種于96孔板（100 μL/孔），37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。OGD/R組細(xì)胞用37℃預(yù)熱的PBS清洗2次（去含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基）后加入不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)，氣體條件為37℃、930 mL/L N2、20 mL/L、50 mL/L CO2。培養(yǎng)12 h后換正常培養(yǎng)液，置于37℃50 mL/L培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)24 h。

1.2.3NaHS對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用NaHS組缺氧處理與OGD/R組相同，只是在恢復(fù)正常培養(yǎng)的同時(shí)分別給予終濃度為0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.5、4.0 mmol/L的NaHS溶液 處理細(xì) 胞；對(duì)照（Control）組僅在37℃50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，不作OGD處理。各組細(xì)胞在進(jìn)行相應(yīng)處理后，均置于37℃50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，隨后在各孔內(nèi)加入CCK-8試劑10 μL，再置 于37℃50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率[6]。每組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)活性檢測(cè)結(jié)果最終選取0.2、0.4、4.0 mmol/L 3個(gè)濃度為后續(xù)NaHS處理組。

1.2.4OGD/R 12 h后細(xì)胞的凋亡水平采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。取OGD處理后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌 細(xì) 胞2次，用1×Binding Buffer懸浮 并 稀 釋細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/L，加入Annexin V-FITC 3 μL，輕懸后4℃避光孵育15 min。加入PI 10 μL，4℃避光孵育5 min[6]。

1.2.5內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)、CCAAT/增 強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins homologous protein,CHOP)及NF-κBP65、COX-2的蛋白表達(dá)采用Western blotting法檢測(cè)。用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，4℃溫度下12 000 r/min離心30 min，取上清液測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度，并調(diào)整各組蛋白濃度到同一水平并上樣，然后電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、一抗4℃孵育過(guò)夜、二抗后孵育、ECL1顯色劑、曝光，掃描各免疫印記條帶后，采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，則采用(±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OGD/R 12 h/24 h后各組細(xì)胞的存活率SHSY5Y細(xì)胞氧糖剝奪12 h后正常培養(yǎng)24 h，OGD/R模型組細(xì)胞活性Control組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與OGD/R模型組比較，NaHS濃度為0~1.0 mol/L時(shí)，細(xì)胞增殖活性升高，NaHS濃度大于2.5mmol/L時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 NaHS處理對(duì)OGD/R介導(dǎo)的細(xì)胞存活的影響Fig.1 The effect of NaHS on OGD/R-mediated SH-SY5Y viability

2.2 OGD/R 12 h/24 h后各組細(xì)胞的凋亡水平SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪12 h后正常培養(yǎng)24 h，圖2的流式細(xì)胞圖顯示，Control組細(xì)胞主要分布在左下象限為活細(xì)胞，而OGD/R模型組細(xì)胞在右上象限（為晚期凋亡細(xì)胞）和右下象限（為早期凋亡細(xì)胞）均有明顯增加，提示OGD/R模型組早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞增加。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞處理12 h時(shí)，OGD/R模型組細(xì)胞的凋亡水平顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與OGD/R模型組比較，0.4 mmol/L濃度的NaHS處理組細(xì)胞的凋亡水平顯著降低，而4 mmol/L NaHS濃度處理組細(xì)胞的凋亡水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 NaHS處理對(duì)OGD/R后細(xì)胞凋亡水平的影響Fig.2 The effect of NaHS on OGD/R-mediated cellular apoptosis in SH-SY5Y

2.3 各組OGD/R 12 h復(fù)氧24 h后細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78及CHOP的蛋白表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪12 h后正常培養(yǎng)24 h，由OGD/R后細(xì)胞的GRP78及CHOP蛋白表達(dá)均顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；用0.2、0.4、4 mmol/L濃度NaHS處 理 后，與OGD/R模 型 組比較，GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但不同劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 NaHS處理對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后GRP78及CHOP的蛋白表達(dá)Fig.3 The effect of NaHS on OGD/R-mediated expression levels of GRP78 and CHOP in SH-SY5Y

2.4 各組細(xì)胞OGD/R 12 h復(fù)氧24 h后細(xì)胞的NF-κBp65及COX-2的蛋白表達(dá)各組細(xì)胞處理12 h時(shí)，OGD/R模 型組細(xì)胞 的NF-κBp65表達(dá)水 平均顯著高于Control組、COX-2蛋白表達(dá)水平均顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與OGD/R模型組比較，0.2、0.4、4 mmol/L濃度NaHS處理組細(xì)胞的NF-κBp65表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P＜0.05）；0.2、0.4 mmol/L細(xì) 胞 的COX-2的蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4)。

圖4 NaHS處理對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞OGD/R后NF-κBp65及COX-2的蛋白表達(dá)Fig.4 The effect of NaHS on OGD/R-mediated expression levels of NF-κBp65and COX-2 in SH-SY5Y

3 討 論

隨著人口老齡化的加劇，VaD發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)[7]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是目前臨床上高致殘率、高致死率的主要疾病之一[8]，也是引起VaD的主要因素之一。新型氣體信號(hào)分子H2S具有重要的生物學(xué)功能，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能研究受到廣泛關(guān)注。WANG等[9]發(fā)現(xiàn)，在局灶腦缺血-再灌注后，H2S能保護(hù)血腦屏障的完整性。外源性H2S能通過(guò)多種機(jī)制防止大鼠全腦的缺血-再灌注損傷[10]。本研究對(duì)SH-SY5Y模擬體外腦缺血OGD/R后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果顯示，OGD/R模型組細(xì)胞的存活率明顯低于對(duì)照組，當(dāng)OGD/R發(fā)生時(shí)，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，提示SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率明顯增高，說(shuō)明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行OGD/R處理后可明顯誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，而H2S能減輕OGD/R引起的細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步探討OGD/R后神經(jīng)元的損傷機(jī)制及H2S的保護(hù)機(jī)制，本研究對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路進(jìn)行研究。在腦缺血后，低能量水平可以破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正常蛋白質(zhì)折疊，導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endo?plasmic reticulum stress,ERS)的激活[11]，GRP78作 為抗凋亡標(biāo)志物在UPR發(fā)生后表達(dá)增加，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù)，在缺血再灌注損傷過(guò)程中引起ERS的刺激持續(xù)存在，ERS過(guò)強(qiáng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能無(wú)法恢復(fù)，引起細(xì)胞凋亡[12]。CHOP作為促凋亡轉(zhuǎn)錄因子，是介導(dǎo)ERS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中至關(guān)重要的蛋白之一，通過(guò)對(duì)GRP78和CHOP表達(dá)水平的分析可以判斷ERS的激活狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R后GRP78及CHOP表達(dá)均較對(duì)照組顯著增高，說(shuō)明氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧損傷進(jìn)一步促進(jìn)了ERS的激活。對(duì)氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧神經(jīng)細(xì)胞用不同濃度NaHS處理后，低劑量0.2 mmol/L處理組GRP78及CHOP的表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明低劑量NaHS抑制了ERS的激活。

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，ERS與NF-κB高度相關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量未折疊和（或）錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)生成增加，可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GRP78，促進(jìn)IRE1α活化，進(jìn)一步激活I(lǐng)κB的上游激酶IKK，使IkB磷酸化后與NF-κB解離，游離NF-κB的亞基p65迅速移位到細(xì)胞核，在核內(nèi)磷酸化為P-p65，與特異性κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的表達(dá)[13]。作為NF-κB下游靶基因，iNOS與COX-2在腦缺血狀態(tài)下迅速被誘導(dǎo)表達(dá)，損傷細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)[6,14]。COX-2為誘生型環(huán)氧化酶，在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中起著重要作用[6,15]。靜息狀態(tài)下，COX-2表達(dá)較少，但是在腦缺血后，神經(jīng)元表達(dá)COX-2和iNOS，作為炎癥因子參與炎癥反應(yīng)同時(shí)激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧(active oxygen,ROS)，細(xì)胞受ROS刺激，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，破壞線粒體膜的通透性，造成線粒體功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙及鈣超載[19,16-17]，引起細(xì)胞凋亡，加重腦缺血損傷。本研究結(jié)果表明，SH-SY5Y細(xì)胞GOD/R后引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活NF-κB，進(jìn)而激活了下游炎癥基因COX-2；課題組前期研究顯示，低劑量H2S可以下調(diào)VaD大鼠海馬組織COX-2、NF-κB的表達(dá)，改善VaD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[18-19]。提示氧糖剝奪再灌注損傷可能是通過(guò)ERS激活誘導(dǎo)NF-κB/COX-2通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TAO等[20]通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型研究表明，在MCAO前24 h，用低濃度的NaHS預(yù)處理實(shí)驗(yàn)小鼠后，可抑制NF-κB的激活，從而減少炎癥發(fā)生，改善小鼠行為，這與課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

本研究還發(fā)現(xiàn)低劑量H2S對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，而高劑量H2S對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用不確定。REN等[21]用180 μmol/kg的 硫 氫 化 鈉(NaHS)預(yù)處理全腦缺血再灌注（global cerebral ischemia/reper?fusion,GCIR）模型大鼠后，加重了GCIR導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，而25 μmol/kg的NaHS則減輕了神經(jīng)元損傷。該研究提示，低濃度外源性的H2S可能對(duì)GCIR所致神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，與本研究的結(jié)果一致。以上均說(shuō)明，低濃度的H2S在改善GCIR中起重要作用。由此可見(jiàn)，在GCIR中給予外源性H2S對(duì)腦組織具有雙向效應(yīng)。這可能與給予的NaHS劑量在體內(nèi)產(chǎn)生H2S的量和自身內(nèi)源性H2S的表達(dá)調(diào)節(jié)能力有關(guān)[22]。

綜上所述，在OGD/R模型細(xì)胞模擬的體外缺血-再灌注損傷后，低濃度NaHS處理OGD/R模型細(xì)胞后，可以提高經(jīng)OGD/R模型細(xì)胞的細(xì)胞活性，抑制缺氧-再灌注對(duì)神經(jīng)元的損傷。這可能與其減輕ERS、降低NF-κBp65、COX-2的蛋白表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)以及下調(diào)細(xì)胞凋亡水平有關(guān)，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的目的。