李 越，董 煒，周曉艷，尹 陽，2，肖姍姍，3，何 謙

（1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710004；2.西電集團醫(yī)院檢驗科，陜西西安710002；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院兒科，陜西西安 710038）

乳腺癌是威脅全球女性健康和生存的常見疾病，發(fā)病率已占據(jù)女性惡性腫瘤的首位[1]。目前，對乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療仍缺乏明顯的突破，針對三陰性乳腺癌的治療也缺乏有效的手段。近年研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物可抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，誘導(dǎo)細胞周期停滯和抑制血管生成[2-5]，但其抑制腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制尚未完全闡明。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）可以抑制乳腺癌MCF-7細胞生長。生物信息學(xué)結(jié)果提示，TGF-β1與CIZ1之間 存 在 蛋白 質(zhì) 相 互作 用 關(guān) 系[6]。因此，本研究將重點研究DHA對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系的抑制作用及其分子機制，為后續(xù)癌癥機制的實驗研究和三陰性乳腺癌治療靶標的探索提供理論基礎(chǔ)，并為研發(fā)青蒿素等天然產(chǎn)物抗腫瘤新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料高侵襲轉(zhuǎn)移性的三陰性乳腺癌MDAMB-231細胞系由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科惠贈。DHA購自合肥巴斯夫生物有限公司（BOSF），重組TGF-β1因子(HEK293 derived)購自美國PeproTech公司，選擇性TGF-β1/Smads通路抑制劑SD208購自上海碧云天生物公司（Beyotime），Trizol試 劑 購 自 美 國Thermal Fisher公 司，Prime?ScriptTMRT Reagent kit購自大連寶生物公司（TaKaRa），SYBR Green熒光定量super mix購自北京全式金生物有限公司(TransGen)，兔抗人CIZ1抗體購自武漢愛博泰克公司Abclonal，兔抗人TGF-β1及兔抗人snail購自 美國Abcam公司，兔抗 人p-smad2/3及兔抗人t-smad2/3購自Cell Signaling Technology，鼠抗人GAPDH購自美國Origene公司。引物（Primer）由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。

1.2 方法

1.2.1MDA-MB-231細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含100 mL/L小牛血清的1640培養(yǎng)基中，37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖情況當細胞進入對數(shù)生長期后分組，行不同干預(yù)措施。實驗組加入含20、40、60、80、120 μmol/L DHA的完全培養(yǎng)液，對照組僅為不含藥的完全培養(yǎng)基。每個藥物濃度有4個平行復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h或48 h。經(jīng)CCK-8溶液處理后在450 nm波長處測定吸光度(A)值，計算細胞生長抑制率（IR）和藥物半數(shù)致死量（IC50）。

1.2.3實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測DHA對CIZ1、Snail及TGF-β1 mRNA表達的影響藥物處理細胞48 h后，得到細胞總RNA并轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，采用熒光定量試劑進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，后運行95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。設(shè)計 的引物如下。CIZ1基 因Primer F：ATATCCAGAGAGGAGTGGAAGG，Primer R：GGCAGATGCGGCAGATATAG；TGF-β1基 因Primer F：CGTGGAGCTGTACCAGAAATAC，Primer R：CACAACTCCGGTGACATCAA；Snail基因Primer F：TCGGAAGCCTAACTACAGCGA，Primer R：AGATGAGCATTGGCAGCGAG；GDAPH基因Primer F：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Primer R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。以2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析，樣本平均CT值表示qRT-PCR擴增結(jié)果。

1.2.4Western blotting檢測DHA對CIZ1、Snail及TGF-β1蛋白表達的影響藥物處理細胞48 h后，按照總蛋白抽提試劑盒說明書操作提取蛋白質(zhì)，將待測蛋白質(zhì)樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜以及封閉后，加入一抗，4℃過夜后棄去一抗，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，室溫孵育2 h后化學(xué)發(fā)光試劑顯色、凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，掃描結(jié)果并通過軟件分析蛋白條帶。

1.2.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力選用于對數(shù)生長期的細胞，將稀釋后的細胞懸液移入6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁且融合約95%后，在孔內(nèi)進行垂直劃線，在各組加入含藥的5 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培 養(yǎng) 基：5 ng/mL TGF-β1因 子、5 ng/mL TGF-β1+40 μmol/L DHA、5 ng/mL TGF-β1+80 μmol/L DHA、5 ng/mL TGF-β1+0.5 μmol/L SD208、5 ng/mL TGF-β1+0.25 μmol/L SD208+40 μmol/L DHA。行不同干預(yù)措施后，培養(yǎng)48 h，分別于0、12、24、48 h在倒置顯微鏡下查看劃痕區(qū)并拍照。

1.2.6Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力在Transwell小室中添加稀釋好的基質(zhì)膠，37℃孵育過夜成膠。在小室中加入細胞懸液，具體分組同1.2.5項所述。下室加入含藥的150 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，行不同處理后繼續(xù)培養(yǎng)16 h，使用結(jié)晶紫進行染色觀察。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以(±s）表示，用GraphPad Prism 7.0作圖，運用SPSS 18.0軟件計算分析統(tǒng)計學(xué)差異。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，3組以上的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；當多組（≥3組）間差異總體具有統(tǒng)計學(xué)意義時，通過Dunnett法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DHA抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖利用CCK-8試驗檢測不同濃度DHA對人乳腺癌細胞增殖能力的影響，選用三陰性乳腺癌MDAMB-231細胞進行實驗。結(jié)果顯示，對照組細胞生長活躍，細胞增殖明顯；經(jīng)DHA處理后，細胞增殖活性受到藥物濃度依賴性抑制（表1），說明DHA能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞增殖。24、48 h處理后，DHA抑制MDA-MB-231細胞增殖的IC50分別為57.40、39.28 μmol/L。

表1 DHA對乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞增殖的影響Tab.1 Effect of dihydroartemisinin on the proliferation of breast cancer cell MDA-MB-231 (±s，n=4）

表1 DHA對乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞增殖的影響Tab.1 Effect of dihydroartemisinin on the proliferation of breast cancer cell MDA-MB-231 (±s，n=4）

與同處理時間的對照組比較，**P＜0.01。

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2.2 DHA抑制乳腺癌細胞CIZ1、TGF-β1、Snail轉(zhuǎn)錄和蛋白表達為探討DHA抑制乳腺癌進展的潛在分子機制，使用qRT-PCR和Western blotting檢測DHA對MDA-MB-231細胞TGF-β1/Smads信號通路和核基質(zhì)蛋白CIZ1分子的影響。結(jié)果顯示，DHA能夠在mRNA表達水平上明顯抑制TGF-β1/Smads信號通路核心分子TGF-β1、Snail和CIZ1的表達，且抑制效應(yīng)呈劑量依賴性（圖1A）。40 μmol/L DHA干預(yù)48 h，對TGF-β1、Snail和CIZ1蛋白表達水平的抑制率分別為60.18%、59.43%和52.29%（圖1B）。DHA呈劑量依賴性地抑制TGFβ1、Snail和CIZ1蛋白的表達水平。

圖1 TGF-β1信號通路和CIZ1參與DHA的抗腫瘤機制Fig.1 TGF-β1 signaling pathway and the role of CIZ1 as the antitumor mechanisms of dihydroartemisinin

2.3 DHA逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的乳腺癌細胞侵襲力增強效應(yīng)多項研究表明，外源施加TGF-β1因子后，腫瘤細胞的侵襲和遷移能力均得到增強，這可能與TGF-β1因子誘導(dǎo)EMT過程促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用有關(guān)[7]。通 過 添 加5 ng/mL TGF-β1，TGF-β1因 子明顯增強了MDA-MB-231細胞的侵襲能力（圖2）。基于DHA與TGF-β1信號通路和CIZ1的調(diào)控關(guān)系，本研究進一步探討了DHA和TGF-β1通路抑制劑SD208對TGF-β1誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)移力增強效應(yīng)的影響，以及DHA和SD-208聯(lián)合治療（更低劑量的兩種藥物同時處理）的應(yīng)用可能性。

Transwell實驗表明，與TGF-β1處理的高侵襲性 細 胞 相 比，40、80 μmol/L DHA能 夠 明 顯 抑 制MDA-MB-231細胞侵襲（圖2），其侵襲抑制率分別為(21.1±4.1)%、(33.6±3.5)%。結(jié)果表明，DHA以劑量依賴性的方式抑制乳腺癌細胞侵襲，逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的高侵襲力現(xiàn)象。而SD-208或聯(lián)合方案均顯示出明顯的侵襲抑制潛能（圖2），對MDA-MB-231細胞的抑制作用分別為(37.0±3.3)%、(52.3±2.5)%。

圖2 對照組、TGF-β1處理的高侵襲性細胞及實驗組侵襲細胞數(shù)目的定量統(tǒng)計結(jié)果Fig.2 Quantitative statistical results of the TGFβ1-treated highly invasive cells and corresponding experimental group cells

2.4 DHA逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的細胞遷移力增強效應(yīng)同2.3項所述，外源應(yīng)用TGF-β1因子顯著增強乳腺癌細胞侵襲（圖2）和遷移能力（圖3），提高了乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力。與TGF-β1誘導(dǎo)相比，40、80 μmol/L DHA能夠明顯降低其遷移能力，其遷移抑制率分別為（39.6±5.6）%、(56.6±4.0)%。表明DHA呈劑量依賴性抑制乳腺癌細胞的遷移能力，發(fā)揮出對TGF-β1誘導(dǎo)的高遷移力現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)效果。SD-208處理對TGFβ1誘導(dǎo)的MDA-MB-231細胞的遷移抑制率為(55.8±4.1)%，而聯(lián)合處理組對其遷移抑制率為(71.95±2.6)%。表明SD-208或聯(lián)合方案均能明顯抑制乳腺癌細胞遷移，聯(lián)合處理組表現(xiàn)出更優(yōu)的抗轉(zhuǎn)移效果。

圖3 對照組、TGF-β1處理的高遷移性細胞及實驗組劃痕面積變化的定量統(tǒng)計結(jié)果Fig.3 Quantitative statistical results of changes in wound area in the TGFβ1-treated high migratory cells and correspond?ing experimental groups

2.5 TGF-β1/Smads通路對DHA抗轉(zhuǎn)移機制的影響如圖4所示，外源添加TGF-β1因子，Smad2/3蛋白的磷酸化水平和Snail蛋白表達明顯高于對照組，提示細胞TGF-β1/Smads通路激活；通路抑制劑SD-208處理細胞，Smad2/3蛋白磷酸化水平和Snail表達降低。因此，促進或抑制TGF-β1/Smads通路活性，使用Western blotting評估MDA-MB-231細胞中CIZ1、P-Smad2/3等蛋白表達水平，從而反映DHA調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制。與TGF-β1誘導(dǎo)的高轉(zhuǎn)移性細胞相比，DHA能明顯下調(diào)CIZ1和Snail表達及Smad2/3蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。DHA呈劑量依賴性抑制TGFβ1/Smads信號通路和CIZ1表達。SD-208以及聯(lián)合處理組均能明顯抑制CIZ1、Snail、磷酸化Smad2/3蛋白表達（P＜0.05）。

圖4 促進/抑制TGF-β1通路，Western blotting檢測DHA對MDA-MB-231細胞CIZ1、Smad2/3、Snail蛋白表達的影響Fig.4 Promotion/inhibition of the TGF-β1 pathway and the effects of dihydroartemisinin on CIZ1,Smad2/3 and Snail pro?tein levels in MDA-MB-231 cells detected by Western blotting

此外，與對照組相比，TGF-β1處理明顯增強了MDA-MB-231細胞CIZ1蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與TGF-β1處理組相比，而SD-208處理則明顯下調(diào)CIZ1表達（P＜0.01）。提示TGF-β1-Smad信號通路和CIZ1之間有緊密的調(diào)節(jié)關(guān)系，并且TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移增強現(xiàn)象與TGFβ1/Smads和CIZ1信號通路密切相關(guān)。

3 討 論

乳腺癌是威脅全球女性健康和生存的常見疾病[1,8]。盡管手術(shù)和放療、化療等治療手段不斷進步，但其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍是乳腺癌患者死亡的主要原因，尤其是針對三陰性乳腺癌的治療尚缺乏有效的手段，成為乳腺癌治療的主要障礙。

DHA、青蒿琥酯是青蒿素的常見衍生物，已成為一種高效、耐受性良好的抗瘧藥[9]。青蒿素及其衍生物的抗癌作用極具應(yīng)用前景，但其作用和分子機制尚未完全證實和闡明。研究表明，青蒿素及其衍生物可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)癌細胞DNA損傷和凋亡、促進癌細胞周期阻滯、抑制腫瘤血管生成、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）過程等，發(fā)揮一定的抗腫瘤效果[2-5]。青蒿琥酯呈劑量依賴性誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DSB），促進癌細胞DHA損傷，進而促進癌細胞死亡[10]。在不同的細胞模型中，青蒿素及其衍生物可以誘導(dǎo)細胞內(nèi)源性、線粒體和外源性的Fas受體驅(qū)動的凋亡通路。DHA處理肺腺癌ASTC-a-1細胞，引發(fā)Bax移位和線粒體膜去極化、細胞色素c釋放，caspase-9/8/3活化，證明了DHA通過caspase-8/Bid激活和線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡[11]。有研究也證明了青蒿素及其衍生物可以在多種腫瘤細胞系中抑制細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。例如，青蒿琥酯可以明顯抑制非小細胞肺癌細胞系侵襲能力，其主要機制與下調(diào)MMP-2和MMP-7表 達 有 關(guān)[13]。

研究表明，EMT與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，EMT過程的出現(xiàn)通常預(yù)示腫瘤惡性改變，并受到Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因 子 和TGF-β等多 通路的調(diào)控[14]。LI等[15]就報道了DHA能夠明顯抑制Snail、Slug和Twist的表達，促進E-cadherin表達，從而抑制卵巢癌EMT過程，發(fā)揮出抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲的作用。已有研究證明，青蒿素類化合物在多個腫瘤細胞系中均可以上調(diào)E-cadherin蛋白表達水平，抑制間質(zhì)標志物Vimentin、N-cadherin水平[2,16]，說明了DHA對腫瘤EMT的抑制能力。

DHA等抗癌化合物的廣譜抗癌特性，其分子機制較復(fù)雜。關(guān)于青蒿素及其衍生物的一些相關(guān)研究集 中 在 其 對WNT/β-catenin、MAPK/ERK、PI3K/AKT途徑的調(diào)控[2,17-18]。目前看來，關(guān)于青蒿素及其衍生物調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制，以及其如何通過信號通路調(diào)節(jié)癌細胞轉(zhuǎn)移，還有待進一步探索。本課題組前期已經(jīng)在乳腺癌MCF-7細胞中探討了DHA和TGF-β1信號通路、核基質(zhì)蛋白CIZ1的調(diào)控關(guān)系[6]。本研究使用了具有更高轉(zhuǎn)移能力的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞，從而重點探究DHA抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用及其分子機制。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA能夠抑制MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲，逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移增強效應(yīng)，并且抑制CIZ1、Snail和磷酸化Smad2/3蛋白的表達水平。

有研究表明，TGF-β1通路主要通過Smads依賴性途徑調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、血管生成和EMT等，從而調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移[19]。核基質(zhì)蛋白CIZ1可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展及其惡性進展中發(fā)揮重要作用，高表達的CIZ1增強腫瘤細胞遷移、侵襲能力，提示CIZ1可能成為癌癥轉(zhuǎn)移的有效診療靶點[20-21]。在對其機制的探索中，ZHANG等[22]表明，CIZ1與轉(zhuǎn)錄因子TCF4相互作用，激活WNT通路，從而上調(diào)通路下游靶點c-Myc、Snail和cyclin D的轉(zhuǎn)錄，促進膽囊癌細胞的增殖和遷移。本研究表明，DHA通過抑制TGF-β1/Smads信號通路和核基質(zhì)蛋白CIZ1，發(fā)揮抑制三陰性乳腺癌細胞增殖轉(zhuǎn)移能力的作用。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231細胞中，核基質(zhì)蛋白CIZ1在TGF-β1誘導(dǎo)后升高，而在TGF-β 1/Smads信號通路抑制劑干預(yù)時表達水平降低，表明TGF-β1/Smads通路與CIZ1具有密切的調(diào)節(jié)關(guān)系，從而初步證實了TGF-β1/Smads信號通路與CIZ1蛋白及其級聯(lián)調(diào)控關(guān)系可能成為調(diào)控三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程的新作用機制。當然，這一發(fā)現(xiàn)仍需要更多的實驗證據(jù)。乳腺癌MDA-MB-231細胞更便于建立體內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移模型，并有利于探討DHA對三陰性乳腺癌的潛在治療前景。進一步研究DHA的抗轉(zhuǎn)移作用和分子機制，從而明確乳腺癌尤其是三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移機制，對于腫瘤預(yù)測、早期診斷及提高治療的成功率有著非常重要的意義。