相壇壇，王明月，呂岱竹，郭建峰，梁水連，戎瑜，周佳

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南 ?？?571101；2.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 038507）

維生素是維持人和動(dòng)物身體健康所必需的一種有機(jī)化合物，人體自身不能合成，必須從外界環(huán)境攝取。水溶性維生素作為維生素重要的一部分，對(duì)維持人體的正常生命活動(dòng)極為重要。如維生素C主要參與人體內(nèi)的羥化反應(yīng)及氧化還原反應(yīng)；維生素B1以輔酶的形式參與人體內(nèi)能量與營養(yǎng)素的代謝；維生素B2主要參與體內(nèi)能量代謝；維生素B6在人體內(nèi)主要參與氨基酸的合成與分解代謝，催化血紅蛋白合成，促進(jìn)肌肉與肝中的糖原轉(zhuǎn)化等；葉酸對(duì)體內(nèi)紅細(xì)胞的合成有著重要的作用。水溶性維生素主要存在于粗糧、動(dòng)物肝臟、蔬菜等食物中[1]，包括維生素C（VC）、維生素B1（VB1）、維生素B2（VB2）、維生素B3（VB3）、維生素B5（VB5）、維生素B6（VB6）、維生素B7（VB7），維生素B9（VB9）和維生素B12（VB12），當(dāng)人體內(nèi)的水溶性維生素不足或過量都會(huì)導(dǎo)致許多疾病發(fā)生[2]。

水溶性維生素很不穩(wěn)定，在酸、堿、光、熱等條件下會(huì)發(fā)生降解，因此對(duì)其分析測定有些困難。傳統(tǒng)的分析方法包括微生物法、分光光度法，隨著現(xiàn)代分析測試技術(shù)的快速發(fā)展，水溶性維生素的檢測方法也變得更加豐富，超臨界色譜法、高效液相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等多種方法也被應(yīng)用于水溶性維生素的檢測中，本文就近十年來現(xiàn)代分析測試技術(shù)在水溶性維生素測定方法中的應(yīng)用進(jìn)行了簡單綜述[3-6]。

1 水溶性維生素的檢測方法

1.1 微生物法

微生物法測定水溶性維生素含量是一種最常見的水溶性維生素檢測方法，是利用微生物的特異性，給予一定的營養(yǎng)條件或改變微生物的生存環(huán)境，通過其生長繁殖和代謝表達(dá)來完成對(duì)單一維生素成分的測定。

早在20世紀(jì)五十年代，英國維生素研究專家就利用微生物對(duì)來自不同動(dòng)物的奶樣中的維生素B12含量進(jìn)行了測定。我國學(xué)者于上世紀(jì)90年代開始使用微生物對(duì)食品中的維生素含量進(jìn)行測定，經(jīng)過近30年不斷的革新發(fā)展，微生物法測定維生素已非常成熟，在2017年頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)中，利用微生物法分別對(duì)食用農(nóng)產(chǎn)品中的煙酸和煙酰胺、泛酸、吡哆素、生物素及葉酸進(jìn)行了測定。

利用微生物對(duì)維生素進(jìn)行測定，微生物本身對(duì)生存環(huán)境極為敏感，且其特異性表達(dá)決定了微生物法檢出限低、靈敏度高、結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也因?yàn)槲⑸镆兹揪?、特異性?qiáng)造成了其具有培養(yǎng)周期長、重現(xiàn)性差、測定結(jié)果單一等缺點(diǎn)。劉冬虹等[7]優(yōu)化建立微生物法快速測定嬰幼兒配方乳粉中的維生素B12、葉酸、生物素、肌醇4種水溶性維生素的方法。該方法利用甘油保護(hù)菌種，節(jié)省菌種制備時(shí)間，簡化試驗(yàn)操作，同時(shí)菌種活力更穩(wěn)定，保證了試驗(yàn)的有效性；采用1.2mL PP小管和移液器進(jìn)行操作，減少了大量移液管、玻璃器具的使用，節(jié)省了大量時(shí)間。該方法解決了傳統(tǒng)微生物法試驗(yàn)周期長、操作復(fù)雜的問題。劉志楠等[8]用乳酸桿菌完成了牛奶中泛酸含量的測定，其在對(duì)泛酸含量測定時(shí)，應(yīng)用了泛酸試劑盒，極大縮短了檢測時(shí)間。各種維生素檢測試劑盒因其簡單快速的優(yōu)點(diǎn)必然將成為檢測維生素含量的一種不可或缺的工具。

微生物法是檢測維生素含量最簡單、最普遍的一種方法，在未來的發(fā)展中應(yīng)該著力于其較差的重現(xiàn)性及檢測單一性等方面，從而使該方法更加完善。

1.2 光度法

光度法也是檢測水溶性維生素的一種常用方法，主要分為分光光度法和熒光光度法。

分光光度法利用水溶性維生素對(duì)紫外光有極強(qiáng)的吸收的特點(diǎn)，測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度。光度法對(duì)水溶性維生素的定性和定量分析，相對(duì)于微生物法，有靈敏度高、操作簡便快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)。葉群利等[9]利用分光光度法完成了黃果柑中維生素C的測定，以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，于420 nm波長處測定吸光度值，結(jié)果準(zhǔn)確、回收率好。但分光光度法在實(shí)際操作中過程繁瑣，花費(fèi)時(shí)間較長，且在測定時(shí)有過多的干擾項(xiàng)，穩(wěn)定性差。

分子熒光法有靈敏度高，檢出能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，一般用于自身含有熒光基團(tuán)或者衍生后能有熒光特性的物質(zhì)，國標(biāo)中維生素B1、維生素B2、泛酸、煙酰胺等都采用了熒光光度法。光度法的缺點(diǎn)在于前處理復(fù)雜，維生素往往要經(jīng)過提取、皂化衍生化等步驟，且不同的維生素往往前處理方法不同，不具備高效快速的特點(diǎn)。

1.3 毛細(xì)管電泳法

高效毛細(xì)管電泳法起步于20世紀(jì)80年代末，是近年來發(fā)展最快的分析方法之一。它是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離分析的液相分離方法。

毛細(xì)管電泳法具有高效、快速、分析對(duì)象廣的優(yōu)點(diǎn)，近年來有許多學(xué)者利用其對(duì)水溶性維生素進(jìn)行了測定?？略聥傻萚10]建立了高效毛細(xì)管電泳同時(shí)測定5種水溶性維生素的方法，該方法在6 min內(nèi)可以對(duì)5種水溶性維生素進(jìn)行分離，以出峰時(shí)間進(jìn)行定性、峰面積進(jìn)行定量，對(duì)食品中的維生素進(jìn)行定性定量分析。尤慧艷[11]采用毛細(xì)管電泳法對(duì)常見的8種水溶性維生素的快速分離分析電泳條件作了比較深入的探討，通過雙模對(duì)接高壓電源，實(shí)現(xiàn)了40 kV以上的超高壓，并通過優(yōu)化其它條件，保證了系統(tǒng)穩(wěn)定性，在2.2 min內(nèi)成功地分離了維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素C、維生素B5、生物素，煙酸和葉酸8種水溶性維生素，為研究水溶性維生素的檢測方法提供了新思路。但毛細(xì)管由于其直徑較小，所以檢測時(shí)靈敏度相對(duì)較低；電滲也會(huì)受到樣品成分的影響，重現(xiàn)性不好。

1.4 液相色譜法

色譜分析是按物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相間分配系數(shù)的差別而進(jìn)行分析、分離的方法，相較于傳統(tǒng)的分析測試方法，色譜法有著更短的檢測時(shí)間，更高的檢測效率，更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)[12]。高效液相色譜用高壓輸液系統(tǒng)，以液體為流動(dòng)相，將具有極性不同的單一溶劑或者比例不同的混合溶液等流動(dòng)相輸送入裝有固定相的色譜分析柱，在柱內(nèi)進(jìn)行分離分配，進(jìn)入合適的檢測器完成對(duì)試樣的分析測試，其較普通液相色譜具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點(diǎn)，且色譜柱可反復(fù)使用，樣品在短時(shí)間內(nèi)可以回收[13]。

水溶性維生素是維持人體生命活動(dòng)必不可少的重要化合物之一，與人體的健康機(jī)能息息相關(guān)，高效液相色譜法是目前測定水溶性維生素最普遍的方法，國內(nèi)外已有許多方法對(duì)其進(jìn)行測定。任丹丹等[14]建立了同時(shí)測定食品中9種維生素的高效液相色譜分析方法，該方法能同時(shí)對(duì)維生素C、硫胺素、核黃素、煙酰胺、吡哆醇、泛酸、生物素、葉酸和氰鈷胺9種水溶性維生素進(jìn)行檢測，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7～0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%～1.35%，檢出限范圍為3 ng/mL～45 ng/mL，加標(biāo)回收率為90.6%～105.4%。郭建博等[15]建立一種快速測定10種水溶性維生素的超高液相色譜的檢測方法，該方法能夠在10 min內(nèi)完成10種水溶性維生素的測定，10種水溶性維生素在該方法下線性關(guān)系良好（r＞0.999），精密度（relative standard deviation，RSD）值小于2%。Saad等[16]建立了快速測定多種食品中水溶性維生素的方法，該方法成功地應(yīng)用于7種水溶性維生素的混合物的分析，平均回收率為98.14%～100.96%。用液相色譜對(duì)水溶性維生素進(jìn)行檢測可實(shí)現(xiàn)高效快速的目的，但在實(shí)際測定中，還需從維生素本身出發(fā)考慮一些問題。

水溶性維生素種類多，不同種類的水溶性維生素其理化性質(zhì)也有很大的差異。不同種類的水溶性維生素在溶液及光、熱、空氣中的穩(wěn)定性見表1。

表1 不同種類的水溶性維生素在溶液及光、熱、空氣中的穩(wěn)定性Table 1 Stability of different kinds of water-soluble vitamins in solution，light，heat and air

林江麗等[17]建立了高效液相色譜同時(shí)測定SO2處理前后無核葡萄干中4種水溶性維生素的分析方法，結(jié)果表明，用SO2處理對(duì)葡萄干中維生素B1的含量影響最大，其他3種B族維生素的含量變化不大。Kim等[18]建立離子對(duì)試劑測定和定量動(dòng)物飼料中6種水溶性維生素的方法，表明利用離子對(duì)試劑對(duì)維生素的分離及測定會(huì)有較大的影響。這些文獻(xiàn)都表明在對(duì)維生素進(jìn)行提取時(shí)應(yīng)注意到提取溶劑可能對(duì)維生素的含量造成一定的影響，要選擇合適的提取溶劑對(duì)維生素進(jìn)行提取，選擇合適的流動(dòng)相對(duì)維生素進(jìn)行分離。

水溶性維生素因其含有如羥基、醛基、共軛雙鍵等生色基團(tuán)，對(duì)紫外光有良好的吸收度。在檢測中，通常用紫外檢測器對(duì)其進(jìn)行分析測定。薛淼等[19]通過高效液相色譜法在波長為266 nm下分別測定了4種茶葉中維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素C和煙酸的含量，為茶葉加工品質(zhì)控制及研究維生素在茶葉加工過程中的變化提供一種檢測方法。王雪梅等[20]采用高效液相色譜法在254 nm的波長下同時(shí)測定了新鮮草莓中維生素C、維生素B1、維生素B2和煙酸的含量，其回收率為96.1%～107.7%，變異系數(shù)為0.912%～1.56%。Rejaul[21]利用紫外檢測器在13 min內(nèi)分離測定了8種水溶性維生素，其回歸系數(shù)r＜0.993，精密度0.3%～2.77%，準(zhǔn)確度83%～124%，這些文獻(xiàn)都表明應(yīng)用紫外檢測器對(duì)維生素進(jìn)行分離測定具有很大的優(yōu)勢。水溶性維生素的紫外最大吸收波長見表2。

表2 水溶性維生素的紫外最大吸收波長Table 2 Maximum UV absorption wavelength of water-soluble vitamins

當(dāng)然，對(duì)水溶性維生素的檢測不僅僅局限于紫外檢測器，許多學(xué)者也用了其他檢測器對(duì)水溶性維生素進(jìn)行了測定，Anna等[22]通過高效液相色譜-光電二極管陣列-熒光法在30 min內(nèi)分離測定了功能飲料中13種水溶性維生素的含量，以及維生素補(bǔ)充劑的含量。Swen等[23]采用紫外-二極管列陣-熒光法依次對(duì)6種水溶性維生素的含量進(jìn)行了測定。在維生素的實(shí)際測定中，不能局限于一種檢測器，可適當(dāng)應(yīng)用不同的檢測器對(duì)其進(jìn)行測定。

液相色譜法在維生素含量的測定中作用顯著，在以后的實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)結(jié)合液相色譜的優(yōu)勢及維生素的理化性質(zhì)開發(fā)出更多、更簡、更優(yōu)的檢測方法。這對(duì)檢測維生素的含量、研究不同種類維生素的作用、維生素的提取利用都將有很重要的意義。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用作為近些年出現(xiàn)的一種新的分析檢測方法，為食品和醫(yī)療等領(lǐng)域的分析檢測技術(shù)提供了更廣闊的發(fā)展前景。液相色譜-質(zhì)譜分析將色譜的高效迅速和質(zhì)譜的高靈敏度、強(qiáng)定性力有效結(jié)合起來，可以同時(shí)對(duì)多種不同樣品進(jìn)行定性及定量分析[24-25]。其先利用高效液相色譜對(duì)不同樣品進(jìn)行有效的分離，然后利用質(zhì)譜檢測器所具有的高專一性、高選擇性、高靈敏度對(duì)不同樣品進(jìn)行分析測定[26]。Hubo等[27]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定煙草制品中咖啡因、?；撬岷?種水溶性維生素（維生素B1、維生素 B2、維生素 B3、維生素 B9、維生素 B12）的方法，線性系數(shù)大于0.997，回收率為95.1%～102.8%，該方法可用于批量測定和檢測煙草制品中水溶性維生素的含量。施煜等[28]建立液相色譜-質(zhì)譜法快速測定運(yùn)動(dòng)飲料中維生素B1、維生素B2、泛酸、維生素B6、生物素、葉酸、維生素B12、煙酸、煙酰胺9種水溶性維生素的方法。相關(guān)系數(shù)大于0.999，回收率為90%～102.3%，該方法適用于運(yùn)動(dòng)飲料中維生素的測定。寧霄等[29]建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法同時(shí)測定保健食品中10種水溶性維生素，10種水溶性維生素在6 min內(nèi)完成分離，線性相關(guān)系數(shù)大于0.997，回收率為85.9%～109.5%，該方法適用于保健食品中維生素的測定。水溶性維生素的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表3。

表3 水溶性維生素的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 3 Parameters of water-soluble vitamins by mass spectrometry

液質(zhì)聯(lián)用在實(shí)際使用中會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確度?；|(zhì)效應(yīng)是指色譜分離時(shí)供洗脫的物質(zhì)改變了待測成分的離子化效率，從而引起信號(hào)的抑制或提高，很大程度上破壞了結(jié)果的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性。通過改善樣品前處理方法、改善色譜條件、改善離子化方式、減小進(jìn)樣量等方法可以減小基質(zhì)效應(yīng)。詹越城等[30]建立了食品中?；撬?、維生素B1、維生素B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維生素B12、生物素12種水溶性維生素含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法較好地減少了基質(zhì)效應(yīng)的影響，有極好的準(zhǔn)確性和高靈敏度。邊麗娜[31]通過建立一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法，對(duì)嬰幼兒配方食品中的11種水溶性維生素進(jìn)行同步檢測。該方法通過優(yōu)化色譜條件減少了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室提高食品檢測效率有著重要意義。

利用液相色譜-質(zhì)譜測定水溶性維生素時(shí)應(yīng)通過不斷優(yōu)化色譜條件、優(yōu)化前處理過程使水溶性維生素檢測流程更簡便、檢測準(zhǔn)確性更好、檢測靈敏度更高。

1.6 超臨界色譜法

超臨界流體色譜法也是近年來發(fā)展較為迅速的一種檢測方法，以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜方法。超臨界流體指的是流體在高于臨界壓力和臨界溫度時(shí)的一種物質(zhì)狀態(tài)，它具有低黏度、高密度及較高的擴(kuò)散系數(shù)等特性。超臨界流體色譜既可以分析氣相色譜法難以處理的高沸點(diǎn)、不揮發(fā)樣品，又有比液相色譜法更高的柱效和更短的分析時(shí)間。理論上講，其應(yīng)用于維生素的定性、定量分析也應(yīng)更加方便。張春蘭等[32]采用超臨界流體色譜快速測定了復(fù)合維生素中3種維生素含量；線性關(guān)系良好，平均回收率介于97.3%～104.8%。竹宏等[33]利用超臨界流體色譜法建立同時(shí)測定維生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B64種水溶性維生素的方法，試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出高效、快速，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。這些試驗(yàn)證明了超臨界流體色譜測定水溶性維生素的可行性，為進(jìn)一步利用超臨界流體色譜測定水溶性維生素提供了思路。

超臨界色譜應(yīng)用于維生素檢測時(shí)，相對(duì)于其他方法具有更高的檢測效率，更短的檢測時(shí)間，但由于有些水溶性維生素的極性限制難以使用超臨界色譜對(duì)其進(jìn)行測定。

2 水溶性維生素檢測方法比較

伴隨現(xiàn)代分析測試技術(shù)的發(fā)展，水溶性維生素檢測方法也越來越多樣化。現(xiàn)階段對(duì)水溶性維生素的檢測主要使用液相色譜法，微生物法和光度法也有使用。國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了一些水溶性維生素的檢測標(biāo)準(zhǔn)，例如在對(duì)食用農(nóng)產(chǎn)品煙酸和煙酰胺的測定標(biāo)準(zhǔn)中，規(guī)定了微生物法和高效液相色譜法2種方法，其中微生物法的檢出限為50 ng/mL～500 ng/mL，液相色譜法的檢出限為煙酸 30 μg/100 g，煙酰胺為 40 μg/10 g。毛細(xì)管電泳法和超臨界色譜法對(duì)水溶性維生素進(jìn)行檢測在近些年也多有報(bào)道。不同水溶性維生素檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比見表4。

表4 不同水溶性維生素檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比Table 4 Comparison of advantages and disadvantages of different water-soluble vitamin detection methods

表4對(duì)近年來水溶性維生素的檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)比，以方便針對(duì)不同檢測需求選擇合適的檢測方法。

3 展望

當(dāng)今，人們已經(jīng)越來越重視健康問題，水溶性維生素作為維持人體生命健康的一種極為重要的有機(jī)化合物，已被越來越多的人關(guān)注和重視。雖然已經(jīng)可以利用液相色譜-質(zhì)譜等方法對(duì)維生素進(jìn)行定性定量分析，但在國標(biāo)方法中對(duì)維生素的測定方法還未更新，且沒有一個(gè)完整有效的包含多種維生素的檢測標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢測標(biāo)準(zhǔn)的更新和拓展應(yīng)作為水溶性維生素檢測的一個(gè)研究方向。同時(shí)，檢測的應(yīng)用面也應(yīng)予以擴(kuò)大，將維生素檢測方法應(yīng)用于飼料、水果、藥品、飲料、發(fā)酵乳制品，以及人體新陳代謝物的研究，這對(duì)食品健康與品質(zhì)的提升，人體健康發(fā)育都有著極其深遠(yuǎn)的意義[34-38]。

近年來，由于各種高新材料及高新技術(shù)的發(fā)展，全球科學(xué)儀器產(chǎn)生天翻地覆的變化，給分析測試的發(fā)展帶來了廣闊的前景，這也意味著水溶性維生素的檢測方法和手段也將越來越先進(jìn)。在未來，采用基因?qū)哟渭夹g(shù)、納米級(jí)材料對(duì)維生素進(jìn)行提取，分子層次的剖析以及全球網(wǎng)絡(luò)的成果共享必然使水溶性維生素的檢測向更微量、過程更高效、結(jié)果更精密的方向發(fā)展，也會(huì)使檢測應(yīng)用面更廣。