吳金松，許美娟，耿廣威，任聰，徐軍，楊新玲，陳曉培

（河南牧業(yè)經濟學院，河南 鄭州 450046）

甘蔗（Saccharum officinarum）屬草本植物禾本科，有薯蔗、糖桿、甜棒兒等別稱，甘蔗稈直立高3 m～5 m，根狀莖粗壯發(fā)達且多汁，是一年生或多年生的草本植物，普遍分布在熱帶和亞熱帶地域，在我國主要分布的兩廣、貴州等南方地區(qū)[1]。甘蔗渣中主要成分為50%左右的纖維素（α、β、γ 3種纖維素）、20%以上的半纖維素、20%以上的木質素、含有機物質和二氧化硅[2-4]。甘蔗中富含多種糖類、蛋白質、維生素（B1、B2、B6）、蔗脂、鈣、磷、鐵、植物甾醇、氨基酸等營養(yǎng)成分。隨著我國制糖產業(yè)的發(fā)展與需求，甘蔗被用于制作糖類物質，每制成1 t的糖類物質就會產生2 t～3 t的甘蔗渣，若這些甘蔗渣不加以利用，會造成環(huán)境污染和資源浪費；對于甘蔗渣的綜合利用主要是包括生物發(fā)電、制漿造紙等[5-8]，而國內外對于從甘蔗渣中提取水溶性多糖的研究鮮有報道，因此探究甘蔗渣多糖的提取工藝對于甘蔗渣資源的再利用具有重要意義。

植物中多糖的提取方法有溶劑提取法、酶提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取等[9]。不同的提取方法各有優(yōu)缺點，根據(jù)原料的處理方式不同采取相應的提取方法。劉寶田等[10]采用纖維素酶提取甘蔗渣多糖，發(fā)現(xiàn)經亞硫酸鹽處理后的甘蔗渣溶液是較易水解的纖維素底物，總糖得率84.23%；肖亞聰[11]采用木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶優(yōu)化甘蔗渣水溶性多糖提取工藝，其中木瓜蛋白酶提取率最高。翁艷英等[12-13]采用超聲輔助提取和解吸-超聲輔助提取甘蔗渣中多糖，并和傳統(tǒng)的水提取法作比較，發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取優(yōu)于傳統(tǒng)水煮法，超聲輔助提取率為0.668%，解吸-超聲輔助提取多糖的提取率平均值達到0.695%，提取率較低。本文擬采用3種酶（中性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶）輔助提取甘蔗渣中多糖，從中篩選出最佳的一種酶[1]，同時結合超聲輔助法考察酶用量、超聲酶解溫度、超聲酶解時間、超聲波功率、酶解pH值等因素對甘蔗渣水溶性多糖提取率的影響，采用正交試驗優(yōu)化，結合方差和極差分析來確定較優(yōu)提取工藝條件，通過紫外吸收掃描和紅外光譜掃描來分析測定多糖組分，為工業(yè)化提取甘蔗渣多糖在功能食品、藥品等領域的應用開發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

紫皮甘蔗：市售。

無水乙醇：新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司；葡萄糖標品、苯酚、溴化鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸（分析純）：洛陽昊華化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）：開封市盛源化工有限公司；果膠酶（食品級，酶活≥100 000 U/g）：上海士鋒生物科技有限公司；中性蛋白酶（食品級，酶活≥100 000 U/g）、纖維素酶（食品級，酶活≥100 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

FA3204B分析天平（感量0.000 1 g）：上海佑科儀器儀表有限公司；101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；pH酸度計：上海雷磁有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；HW-3型紅外烘干箱：天津市拓普儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器有限公司；BJ-150多功能粉碎機：德清拜杰電器有限公司；Hanon i2可見光分光光度計：濟南海能儀器股份有限公司；TU-1901雙光束紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；is10傅里葉變換紅外光譜儀：美國尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 流程

新鮮甘蔗→去皮、榨汁→收集甘蔗渣→烘干→粉碎→過篩（50目）→得到甘蔗渣粉→準確稱取3.000 g甘蔗渣粉→調節(jié)酶解pH值→超聲輔助酶解→抽濾→稀釋濾液→測量吸光值→計算多糖提取率→濾液濃縮→醇沉→抽濾→干燥→紫外吸收掃描→紅外光譜測定。

1.3.1.1 甘蔗渣樣品前處理

把新鮮的甘蔗去皮保留干凈的甘蔗，通過榨汁后得到甘蔗渣，把得到的甘蔗渣放入電熱鼓風干燥箱中，調節(jié)溫度為60℃，烘干6 h～8 h，將干燥后的甘蔗渣放進粉碎機中粉碎，將粉碎后的甘蔗渣粉過篩（50目），將得到的甘蔗渣粉放入密封袋中備用。

1.3.1.2 甘蔗渣粉酶解液的制備

準確稱取3.000 g甘蔗渣粉，按一定的料液比（甘蔗渣粉和蒸餾水比例）配制溶液，通過pH計對溶液進行酶解pH值的調節(jié)，調節(jié)pH值所用的緩沖溶液為1∶50（g/L）的乙酸分析純稀釋液，調節(jié)到所需的酶解pH值。調好pH值后，加入一定比例的酶，進行充分攪拌。

1.3.1.3 超聲波輔助提取

將溶液放入超聲波清洗機中，按照需要的條件設置參數(shù)進行超聲。

1.3.1.4 抽濾

將超聲酶解后的溶液通過布氏漏斗和抽濾瓶在真空泵作用下抽濾，收集抽濾好的濾液。

1.3.1.5 旋轉蒸發(fā)

將得到的濾液放入旋轉蒸發(fā)儀中進行濃縮，調節(jié)旋轉蒸發(fā)儀參數(shù)為溫度60℃，轉速70 r/min，將濾液旋轉蒸發(fā)至10 mL～20 mL。

1.3.1.6 醇沉多糖

將旋轉蒸發(fā)后的濾液，按照1∶4的體積比加入95%乙醇溶液，將混勻的溶液放置在4℃的冰箱中靜置醇沉12 h。

1.3.1.7 干燥

將醇沉后的溶液進行抽濾，將得到的沉淀物放入鼓風干燥箱中進行干燥，設置參數(shù)為溫度60℃，干燥4 h，得到干燥后的多糖。

1.3.2 超聲結合酶法輔助提取甘蔗渣多糖的單因素試驗

影響超聲結合酶法輔助提取植物多糖的主要因素有輔助酶的種類、酶添加量（%）、酶解pH值、料液比（g/mL）、超聲酶解時間（min）、超聲酶解溫度（℃）、超聲功率（W）[14-17]，選擇此為單因素進行試驗，平行測定3次。

1.3.2.1 不同酶對甘蔗渣多糖提取率的影響

準確稱取3份3.000 g甘蔗渣粉，分別添加不同種類的酶（果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶）。固定料液比1∶30（g/mL）、酶添加量 4.0%、酶解 pH 5.0、超聲酶解時間40 min、超聲酶解溫度50℃、超聲功率300 W。將溶液超聲酶解，真空泵抽濾，得到濾液，稀釋得到的濾液進行吸光值的測定，計算多糖的提取率，探究酶的種類對多糖提取率的影響，通過此試驗確定最優(yōu)酶的種類，以備后續(xù)試驗選用。

1.3.2.2 酶添加量對甘蔗渣多糖提取率的影響

準確稱取5份3.000 g甘蔗渣粉，分別設置加酶量3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%。其它步驟同 1.3.2.1，探究酶添加量對多糖提取率的影響。

1.3.2.3 酶解pH值對多糖提取率的影響

準確稱取5份3.000 g甘蔗渣粉，分別設置酶解pH 值為 4.6、4.8、5.0、5.2、5.4，其它步驟同 1.3.2.1，探究酶解pH值對多糖提取率的影響。

1.3.2.4 料液比對多糖提取率的影響

準確稱取5份3.000 g甘蔗渣粉，分別設置料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），其它步驟同 1.3.2.1，探究料液比對多糖提取率的影響。

1.3.2.5 超聲酶解時間對多糖提取率的影響

準確稱取5份3.000 g甘蔗渣粉，分別設置超聲酶解時間 20、30、40、50、60 min，其它步驟同 1.3.2.1，探究超聲酶解時間對多糖提取率的影響。

1.3.2.6 超聲酶解溫度對多糖提取率的影響

準確稱取5份3.000 g甘蔗渣粉，分別設置超聲酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃，其它步驟同 1.3.2.1，探究超聲酶解溫度對多糖提取率的影響。

1.3.2.7 超聲功率對多糖提取率的影響

準確稱取5份3.000 g甘蔗渣粉，分別設置超聲功率 200、250、300、350、400 W，其它步驟同 1.3.2.1，探究超聲功率對多糖提取率的影響。

1.3.3 超聲結合酶法輔助提取甘蔗渣多糖的正交試驗優(yōu)化

分析單因素試驗結果，選酶解pH值、料液比（g/mL）、超聲酶解溫度（℃）、超聲功率（W）進行L9（34）正交試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal experimental factors level

1.3.4 甘蔗渣多糖提取率的測定

1.3.4.1 葡萄糖含量標準曲線的繪制

采用硫酸-苯酚法[18]繪制葡萄糖溶液標準曲線。準確稱取0.1000 g無水葡萄糖，用蒸餾水將其溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液，用5.0 mL的移液管吸取5.0 mL定容好的1.0 mg/mL葡萄糖溶液放入50 mL的容量瓶中，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，以備后續(xù)試驗使用。使用干燥潔凈并編號的試管，用1.0 mL的移液管分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 定容好的 0.1 mg/mL 葡萄糖溶液放入試管中，再用1.0 mL的移液管吸取1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL 的蒸餾水使其總體積為 1.0 mL，再用1.0 mL的移液管吸取1.0 mL配制好的5%苯酚溶液，用5.0 mL移液管吸取5.0 mL的濃硫酸，立即振蕩均勻，靜置30 min，測量490 nm處吸光值，根據(jù)每組測出的吸光值繪制葡萄糖標準曲線，回歸方程為y=0.010 5x＋0.000 8，相關系數(shù)為R2=0.998 6。

1.3.4.2 甘蔗渣多糖提取率的測定

根據(jù)測量溶液的吸光值，計算出多糖濃度，再根據(jù)公式[19]計算多糖的提取率。

式中：C為從葡萄糖標準曲線上計算得到的濃度，μg/mL；V為抽濾后得到的濾液體積，mL；D為取一定濾液稀釋的倍數(shù)；m為稱取甘蔗渣的質量，g。

1.3.5 甘蔗渣多糖的紫外全波段掃描

稱取0.500 0 g，按照最優(yōu)試驗方案提取的甘蔗渣多糖加蒸餾水定容至100 mL，配制成5 μg/mL溶液，設置波長范圍為190 nm～400 nm，通過雙光束紫外可見分光光度計測量吸收峰，觀察圖譜[20]。

1.3.6 甘蔗渣多糖的紅外光譜測定

稱取0.010 0 g，按照最優(yōu)試驗方案提取的甘蔗渣多糖放在表面皿上，放進紅外干燥箱中，干燥后將其放在研缽中，按比例1∶100（g/g）加入溴化鉀晶體進行研磨。將研磨后的粉末進行壓片，采用傅里葉紅外光譜儀測量官能團的伸縮振動峰[21]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.6和Excel軟件對數(shù)據(jù)進行制圖，采用正交表對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素對甘蔗渣多糖提取率的影響

2.1.1 不同輔助酶對多糖提取率的影響

不同輔助酶對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 不同酶提取甘蔗渣多糖提取率Fig.1 The extraction rate of crude polysaccharide from bagasse with different enzymes

根據(jù)圖1所示，果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶的提取率分別為4.87%、9.69%、5.55%，采用纖維素酶作為輔助酶時提取率要高于果膠酶和中性蛋白酶，這可能是因為甘蔗渣中含有大量的纖維素和半纖維素。因此選擇纖維素酶進行酶解試驗效果會更好。

2.1.2 酶添加量對多糖提取率的影響

酶添加量對多糖提取率的影響見圖2。

根據(jù)圖2所示，在纖維素酶添加量為底物質量的3.0%～5.0%時，提取率隨酶添加量的增加呈上升趨勢。當酶添加量為4.5%時，酶分子逐漸趨向飽和狀態(tài)，會有一部分的酶分子失去與甘蔗渣多糖結合的機會，會造成甘蔗渣中多糖溶解的速度下降[22]，導致提取率不再顯著上升。從成本的角度考慮，選擇酶的添加量為底物質量4.5%為最佳。

圖2 不同酶添加量對甘蔗渣多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different enzyme addition on the extraction rate of crude polysaccharide from bagasse

2.1.3 酶解pH值對多糖提取率的影響

酶解pH值對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 不同酶解pH值對甘蔗渣多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis of pH on extraction rate of crude polysaccharide from bagasse

根據(jù)圖3所示，多糖提取率在酶解pH值的影響下呈先升后降的趨勢，在酶解pH值為4.6～5.0時，多糖提取率呈上升趨勢；在酶解pH值為5.0～5.4時，多糖提取率為下降趨勢。酶解pH值的改變會造成酶的活性降低、空間結構被破壞、影響酶活性中心催化基團的解離[23]。酶解pH值對甘蔗渣多糖提取率影響較顯著，因此把酶解pH值作為正交試驗的一個因素，選擇pH 5.0、5.2、5.4 3 個水平進行試驗。

2.1.4 料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖4。

根據(jù)圖4所示，多糖提取率隨溶劑的增加呈先上升后下降的趨勢，在料液比為1∶40（g/mL）時，多糖提取率最高。這可能是因為溶劑用量較低時，溶液的濃度大，多糖的溶出達到飽和狀態(tài)，多糖提取率不高；隨著溶劑用量升高，溶劑對超聲波能量吸收也在逐漸增大，造成底物對超聲波能量的吸收減小，細胞壁被破壞的不完全，溶出減少，因此多糖提取率下降[24]。提取率在料液比的影響下較顯著，因此可將料液比作為正交試驗的一個因素，選擇料液比為 1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）作為3個水平進行試驗。

圖4 料液比對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of different material-liquid ratio on extraction rate of crude polysaccharide from bagasse

2.1.5 超聲酶解時間對多糖提取率的影響

超聲酶解時間對多糖提取率的影響見圖5。

圖5 超聲酶解時間對甘蔗渣多糖提取率的影響Fig.5 Effect of different enzymatic time on the extraction rate of crude polysaccharide from bagasse

根據(jù)圖5所示，多糖提取率隨著超聲酶解時間的延長呈上升趨勢，在超聲酶解時間為60 min時，多糖提取率最高。這可能是因為超聲時，甘蔗渣細胞破碎的程度較大，使多糖溶出，增大了提取率。在超聲酶解時間40 min后，多糖提取率增加緩慢，為了能達到最好的提取效果，選擇超聲酶解時間60 min為固定因素。

2.1.6 超聲酶解溫度對多糖提取率的影響

超聲酶解溫度對多糖提取率的影響見圖6。

根據(jù)圖6所示，多糖提取率隨著超聲酶解溫度升高呈先上升后下降的趨勢，在超聲酶解溫度為55℃時達到最高值。這可能是因為液體介質的表面張力與黏性下降、擴散系數(shù)變大，多糖提取率上升[25]。在超聲酶解溫度50℃后，多糖提取率逐漸增大且顯著，可以把超聲酶解溫度作為正交試驗的一個因素，選擇超聲酶解溫度為50、55、60℃作為3個水平進行試驗。

圖6 不同超聲酶解溫度對甘蔗渣多糖提取率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of polysaccharide from bagasse

2.1.7 超聲功率對多糖提取率的影響

超聲功率對多糖提取率的影響見圖7。

圖7 超聲功率對甘蔗渣多糖提取率的影響Fig.7 Effect of different ultrasonic power on the extraction rate of crude polysaccharide from bagasse

根據(jù)圖7所示，多糖提取率隨著超聲功率的增加呈先升后降的趨勢。在超聲功率為350 W時，多糖提取率達到最高值。這可能是因為功率越高，產生的空化作用越大，但功率過高時，會發(fā)生空化屏障現(xiàn)象，從而影響提取率[26]。超聲功率對提取率影響較顯著，可將超聲功率作為正交試驗的一個因素，選擇超聲功率為300、350、400 W作為3水平進行試驗。

2.2 正交試驗結合方差分析結果

正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results

根據(jù)表3所示，影響提取率的主次因素為C＞B＞D＞A，即超聲酶解溫度＞酶解pH值＞超聲功率＞料液比。臨界值F0.05（2，9）=4.26，F(xiàn)0.01（2，9）=8.02，因素A、B、C、D對提取率有極顯著影響，最優(yōu)的提取方案是C2B1D2A1，即超聲酶解溫度為55℃、酶解 pH 5.0、超聲功率350 W、料液比1∶30（g/mL）。在最優(yōu)水平C2B1D2A1提取條件下，平行測定3次，多糖平均提取率為12.78%，比優(yōu)化之前提取率高了16.78%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.3 紫外吸收曲線

甘蔗渣多糖的紫外掃描圖譜見圖8。

圖8 甘蔗渣多糖紫外掃描圖譜Fig.8 Ultraviolet spectrum of crude polysaccharide from bagasse

根據(jù)圖8所示，設置波長在190 nm～400 nm進行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在260 nm～280 nm無特征吸收峰，說明多糖中不含核酸和蛋白質。

2.4 紅外掃描圖譜

甘蔗渣多糖的紅外掃描圖譜見圖9。

根據(jù)圖9所示，甘蔗渣多糖具有多糖的一般吸收峰。通過把壓片放在4 000 cm-1～400 cm-1處觀察吸收峰來確定物質是否為多糖。在3 416.90 cm-1處的吸收峰為O-H鍵，為分子內氫鍵；在2 922.96 cm-1處的吸收峰為-CH2-；在1 654.00 cm-1處的吸收峰為羰基和-C=C-；在1 112.25 cm-1和1 061.30 cm-1處有兩個吸收峰，為糖苷鍵[20]。結果表明，符合多糖的基本特征。

圖9 甘蔗渣多糖紅外掃描圖譜Fig.9 Infrared spectrum of crude polysaccharide from bagasse

3 結論

通過試驗選擇出最適合的酶為纖維素酶，采用超聲結合纖維素酶輔助提取甘蔗渣中水溶性多糖，采用單因素試驗和正交試驗對提取方法做進一步的優(yōu)化。最佳工藝條件：即料液比 1∶30（g/mL）、酶解 pH 5.0、纖維素酶添加量為底物質量的4.5%、超聲功率350W、超聲酶解時間60 min、超聲酶解溫度55℃，多糖提取率為12.78%，比優(yōu)化前提高了16.78%。通過紫外吸收掃描圖譜顯示在260 nm～280 nm無特征吸收值，表明提取的多糖不含核酸和蛋白質，通過紅外光譜掃描圖譜顯示提取的物質符合多糖的基本特征。