于海洋，彭新顏，崔曉穎，常高坦，劉凱麗

（1.山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東 煙臺(tái) 264670；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

我國(guó)是世界第一大淡水魚(yú)生產(chǎn)消費(fèi)國(guó)，隨著魚(yú)類產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在魚(yú)類加工過(guò)程中產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，占魚(yú)類總產(chǎn)量的30%～50%，其中每年魚(yú)鱗下腳料就高達(dá)30萬(wàn)噸[1]。研究表明，魚(yú)鱗含有豐富的蛋白質(zhì)，較多的卵磷脂、多種不飽和脂肪酸，還含有鈣、鐵、鋅等多種礦物質(zhì)和多種微量元素。但由于加工技術(shù)落后、資源綜合利用觀念薄弱，魚(yú)鱗在加工時(shí)多數(shù)被直接丟棄，易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[2-3]。

近年來(lái)，利用酶水解技術(shù)對(duì)海洋資源副產(chǎn)物進(jìn)行高值化、生態(tài)化利用，特別是功能多肽的制備日益受到國(guó)內(nèi)外專家的關(guān)注[4-6]。研究表明，抗氧化肽的活性不僅與原料的來(lái)源、理化性質(zhì)有關(guān)，還受抗氧化肽的制備工藝及水解程度等影響。但國(guó)內(nèi)對(duì)海洋廢棄物多肽的抗氧化效果評(píng)價(jià)多限于某些化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定，靈敏度不高。電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）法可用于定性和定量檢測(cè)物質(zhì)原子或分子中所含的不配對(duì)電子，是目前檢測(cè)自由基最靈敏的方法[7]。因此，本研究以消費(fèi)量較大的淡水魚(yú)——鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）的魚(yú)鱗為原料，利用ESR法測(cè)定堿性蛋白酶解產(chǎn)物的自由基清除能力和Fe2＋螯合能力，并通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化抗氧化肽的制備條件，以期為淡水魚(yú)鱗的深加工及綜合利用提供技術(shù)指導(dǎo)，并有望提高魚(yú)鱗的利用率和附加值，為生產(chǎn)功能性食品尋求新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淡水魚(yú)鱗：市售；堿性蛋白酶（6×104U/g）：丹麥諾維信（NOVO）公司；丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、二甲基吡咯啉氮氧化物（dimethyl pyrroline nitrogen oxide，DMPO）、菲洛嗪（Ferrozine）：Sigma公司；抗壞血酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、核黃素、氯化亞鐵（分析純）：煙臺(tái)魯杰試劑公司。

ER 200D-SRC電子自旋共振儀（ESR儀）：德國(guó)Bruker公司；GT16-3型高速臺(tái)式離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；AL-104型精密電子天平：瑞士梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；pB-10型pH計(jì)：新銳儀表儀器有限公司；UV2600/2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；ZHWY-1102雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LGJ-18S真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 魚(yú)鱗膠原粗蛋白酶解過(guò)程

參考華萍[8]的試驗(yàn)方法并有所改動(dòng)：洗凈魚(yú)鱗→烘干、切碎→酸浸脫鈣（0.4 mol/L HCl，浸泡24 h并換一次酸）→清水沖洗至中性→石灰水浸泡24 h除雜→沖洗過(guò)濾至中性→調(diào)整pH值至2.5→35℃下胃蛋白酶提取膠原蛋白（提取60 h）→過(guò)濾后將濾液鹽析24 h（0.9 mol/L氯化鈉）→離心（16 000×g，20 min）→透析24 h后凍干→得膠原蛋白→酶解→離心分離（4 000×g，20 min）→取上清液濃縮→真空干燥→得魚(yú)鱗膠原蛋白酶解物。

1.3 水解度的測(cè)定

根據(jù)pH-Stat法[9]，水解度計(jì)算公式為：DH/%=h/htot×100，式中：htot為每克蛋白質(zhì)具有肽鍵的毫摩爾數(shù)，mmol/g蛋白質(zhì)，魚(yú)鱗膠原蛋白htot為8.41 mmol/g蛋白質(zhì)[10]；h為每克蛋白質(zhì)中水解的肽鍵量，mmol/g蛋白質(zhì)。

1.4 ESR法測(cè)定羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力

羥基自由基由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，參照Liu等[11]的方法稍有改動(dòng)。水解樣品（50 μL）作對(duì)照，依次加入到50 μL的二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO）、10 mmol/L的硫酸亞鐵、50 μL的過(guò)氧化氫（10 mmol/L）溶液，啟動(dòng)反應(yīng)，將反應(yīng)體系吸入密封的毛細(xì)管中，3 min后用ESR光譜儀記錄DMPO-OH加合物圖譜。ESR操作參數(shù)：中心磁場(chǎng)3 385 Gs，微波功率20 mW，調(diào)制頻率100 kHz，調(diào)制幅度1.0 Gs，掃場(chǎng)時(shí)間300 s。超氧自由基利用紫外照射的EDTA/核黃素系統(tǒng)產(chǎn)生[12]?；靹蚝笥?65 nm紫外燈下照射1 min，吸入石英毛細(xì)管后測(cè)定。

清除率/%=（H0－H）/H0×100

式中：H和H0分別為樣品與空白波譜信號(hào)強(qiáng)度。其中羥基自由基以波譜信號(hào)第2個(gè)峰信號(hào)強(qiáng)度（高度）表示；超氧自由基以波譜第一峰來(lái)表示。

1.5 Fe2＋螯合能力的測(cè)定

參照彭新顏等[9]的方法稍作修改進(jìn)行研究。對(duì)于Fe2＋的鰲合：1 mL 20 μmol/L 的 FeCl2與 1 mL 0.5 mmol/L的菲咯嗪混合后向其中添加0.5 mL的魚(yú)鱗水解物，在562 nm下讀取吸光值。

1.6 堿性蛋白酶單因素水解試驗(yàn)

1.6.1 最佳酶解溫度

在酶解時(shí)間為4 h，底物濃度20 mg/mL，加酶量4%，pH8.5的條件下，選取酶解溫度分別為50、55、60、65、70℃，研究酶解溫度對(duì)水解度和O2-·、·OH清除率的影響。

1.6.2 最適加酶量

在底物濃度20 mg/mL，酶解時(shí)間為4 h，pH8.5，酶解溫度65℃的條件下，選取酶的添加量分別為2%、3%、4%、5%、6%，研究加酶量對(duì)水解度和 O2-·、·OH 清除率的影響。

1.6.3 最佳底物濃度

在酶解時(shí)間為4 h，pH8.5，加酶量為4%，酶解溫度65℃的條件下，選取底物濃度分別為5、10、15、20 mg/mL，研究底物濃度對(duì)水解度和O2-·、·OH清除率的影響。

1.6.4 最適pH值

在酶解時(shí)間為4 h，加酶量為4%，酶解溫度65℃，底物濃度20 mg/mL的條件下，選取pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，研究 pH 值對(duì)水解度和 O2-·、·OH 清除率的影響。

1.6.5 最適水解時(shí)間

在加酶量4%，底物濃度20 mg/mL，pH8.5，酶解溫度 65 ℃的條件下，在酶解時(shí)間分別為 1、2、3、4、5 h，研究酶解時(shí)間對(duì)水解度和O2-·、·OH清除率的影響。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素篩選出酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間作為優(yōu)化因素，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)，以O(shè)2-·、·OH清除率和Fe2＋螯合能力為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析，數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.0，因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Box-Behnken experimental design

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Sigmaplot12.0和Excel6.0作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix8.1軟件包中Linear Models程序和Design-Expert 8.0分析軟件，差異顯著性（P＜0.05）使用Tukey HSD程序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度和加酶量的確定

酶解溫度和加酶量對(duì)魚(yú)鱗蛋白水解效果的影響見(jiàn)圖1。

圖1 酶解溫度和加酶量對(duì)魚(yú)鱗蛋白水解效果的影響Fig.1 Effect of temperature and enzyme dose on hydrolysis efficiency of carp scales protein

如圖1所示，當(dāng)酶解溫度為65℃時(shí)，·OH清除率、O2-·清除率及水解度全部達(dá)到最大值，分別為84.33%、47.27%和34.83%。這是因?yàn)樘岣邷囟群?，酶解速度顯著提高，從而促進(jìn)魚(yú)鱗膠原蛋白水解為抗氧化多肽。當(dāng)酶解溫度過(guò)高時(shí)，蛋白酶失活變性，降低了酶解效率，導(dǎo)致·OH清除率、O2-·清除率及水解度下降。因此，酶解溫度不宜過(guò)高，65℃較適宜。酶濃度會(huì)影響魚(yú)鱗膠原蛋白的酶解效果，從而影響酶解液的抗氧化活性[13]。由圖1可知，加酶量提高后，·OH清除率在加酶量為4%時(shí)取得最大值為71.20%，O2-·清除率在加酶量為6%時(shí)才能取得最大值為38.33%，水解度在加酶量為5%時(shí)取得最大值為42.47%，但由于此時(shí)水解過(guò)度，導(dǎo)致·OH清除率和O2-·清除率下降。綜合考慮成本等因素，加酶量采用4%。

2.2 底物濃度、pH值和酶解時(shí)間的確定

底物濃度、pH值和酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)鱗蛋白水解效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 底物濃度、pH值和酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)鱗蛋白水解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration，pH and hydrolysis time on hydrolysis efficiency of carp scales protein

如圖2所示，底物濃度在5mg/mL～25mg/mL，隨著底物濃度的增加，·OH清除率、O2-·清除率及水解度逐漸增大，但當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃蟮揭欢ǔ潭群?，其變化就較平緩。在25 mg/mL時(shí)，·OH清除率以及水解度達(dá)到最大值，分別為86.73%和45.03%。但O2-·清除率在20 mg/mL時(shí)最大，達(dá)到38.57%，而在這兩種底物濃度時(shí)，水解物的·OH清除率、O2-·清除率及水解度方面并沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。這可能是由于低濃度的魚(yú)鱗膠原蛋白可有效地和酶接觸，而當(dāng)魚(yú)鱗膠原蛋白濃度進(jìn)一步升高時(shí)，酶與底物接觸的機(jī)會(huì)減小，膠原蛋白未被完全水解，酶解液的抗氧化活性也受到影響[14]。因此，底物濃度以20 mg/mL為宜。

酶解環(huán)境的pH值能夠影響到酶的穩(wěn)定性、空間構(gòu)象、解離程度和解離狀況等方面，進(jìn)而影響酶解反應(yīng)[15]。如圖2所示，隨著pH值的增大，·OH清除率、O2-·清除率和水解度開(kāi)始逐漸增大，當(dāng)pH值為8.5時(shí)，·OH、O2-·清除率及水解度均達(dá)到最大值，分別為68.87%、52.77%和44.20%。此后，隨著pH值進(jìn)一步增加，酶解液的自由基清除率和水解度均開(kāi)始下降。以上結(jié)果說(shuō)明，酶解pH值與水解物抗氧化活性之間不存在線性關(guān)系，酶解pH值以8.5為宜。

如圖 2 所示，在 1 h～4 h，·OH、O2-·清除率和水解度不斷上升，在 4 h 時(shí)，·OH、O2-·清除率、水解度全部達(dá)到最高值，分別為82.60%、54.77%和42.43%，表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化效果。酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，抗氧化效果反而下降。說(shuō)明酶解時(shí)間與魚(yú)鱗水解物抗氧化活性之間不存在線性關(guān)系，只有在特定的水解度下，才具有最大的抗氧化能力。這可能是因?yàn)榫哂锌寡趸钚缘碾亩伪贿M(jìn)一步水解為更小的肽段和氨基酸，導(dǎo)致肽段失活變性。所以，酶解時(shí)間以4 h為宜。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間為變量，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。堿性蛋白酶解工藝條件優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組試驗(yàn)，5組為中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

本試驗(yàn)利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)O2-·清除率、·OH清除率與Fe2＋螯合能力等因素進(jìn)行多元回歸擬合，得二次多項(xiàng)式擬合方程為Y1=65.22＋4.98X1-0.84X2＋5.79X3＋1.62X1X2＋1.38X1X3＋0.53X2X3-7.65X12-3.50X22-4.39X32，Y2=86.23 ＋5.11X1＋2.47X2＋5.48X3-1.14X1X2＋5.92X1X3＋1.04X2X3-10.98X12-11.21X22-16.07X32，Y3=59.97＋2.40X1＋0.716X2＋3.29X3＋1.42X1X2＋1.23X1X3-0.98X2X3-5.30X12-5.74X22-4.24X32。

O2-·清除率、·OH 清除率、Fe2＋螯合能力的二次回歸方程方差分析見(jiàn)表3、表4和表5。

表3 O2-·清除率的二次回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation of O2-·scavenging activity

表4 ·OH清除率的二次回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation of·OH scavenging activity

由表3可知，方程回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9832，P＜0.000 1，說(shuō)明模型達(dá)到高度顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.165 2，影響不顯著，說(shuō)明該方程擬合良好；由表4可知，方程回歸模型的決定系數(shù)R2=0.988 8，P＜0.000 1，說(shuō)明模型達(dá)到高度顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.056 4，影響不顯著，說(shuō)明該方程擬合良好；由表5可知，方程回歸模型的決定系數(shù)R2=0.987 8，P＜0.000 1，說(shuō)明模型達(dá)到高度顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.093 1，影響不顯著，說(shuō)明該方程擬合良好。因此，可應(yīng)用3個(gè)方程描述各響應(yīng)變量與兩個(gè)相應(yīng)值之間的關(guān)系，以評(píng)價(jià)各因素對(duì)相應(yīng)值影響的顯著性。

表5 Fe2+螯合能力的二次回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation of Fe2+chelating ability

由表3可以看出，響應(yīng)值為O2-·清除率的模型：一次項(xiàng)X1（酶解溫度）和X3（酶解時(shí)間）影響極顯著，各響應(yīng)因素影響程度依次為X3＞X1＞X2，酶解時(shí)間對(duì)于酶解液O2-·清除率的影響最大；酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值的交互作用影響不顯著；二次項(xiàng)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值影響均極顯著。

響應(yīng)值為·OH清除率的模型：一次項(xiàng)X1（酶解溫度）和X3（酶解時(shí)間）影響極顯著，一次項(xiàng)X2（pH值）對(duì)·OH清除率達(dá)到顯著水平，各響應(yīng)因素影響程度依次為X3＞X1＞X2，酶解時(shí)間對(duì)于酶解液·OH清除率的影響最大；酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用影響極顯著，酶解溫度與pH值、pH值與酶解時(shí)間交互作用影響不顯著；二次項(xiàng)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值影響均極顯著。

響應(yīng)值為Fe2＋螯合能力的模型：一次項(xiàng)X1（酶解溫度）和X3（酶解時(shí)間）影響極顯著，一次項(xiàng)X2（pH值）對(duì)Fe2＋螯合能力未達(dá)到顯著水平，各響應(yīng)因素影響程度依次為 X3＞X1＞X2，酶解時(shí)間對(duì)酶解液 Fe2＋螯合能力的影響最大；酶解溫度與pH值、酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用影響顯著，pH值與酶解時(shí)間交互作用影響不顯著；二次項(xiàng)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值影響均極顯著。各因素對(duì)響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3～圖5。

圖3 各因素對(duì)O2-·清除率的影響Fig.3 Response surface plots for the interactive effects of different variables on O2-·scavenging activity

通過(guò)圖3、圖4和圖5即可對(duì)各因素影響抗氧化活性效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。響應(yīng)面為平滑的曲面，且開(kāi)口向下，說(shuō)明在響應(yīng)曲面上存在最大響應(yīng)值，可從中確定最佳因素水平范圍。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的二次多項(xiàng)式回歸方程和結(jié)果，對(duì)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化，得到最佳酶解條件組合為pH8.56、酶解溫度66.66℃、酶解時(shí)間4.39 h，此時(shí)O2-·清除率為67.94%，·OH清除率為87.30%，F(xiàn)e2+螯合能力為61.00%。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，根據(jù)實(shí)際對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整后，選取酶解時(shí)間4.4 h、pH8.5、酶解溫度66.0℃，做3組平行試驗(yàn)，得到的O2-·清除率達(dá)65.34%，·OH清除率80.24%，F(xiàn)e2+螯合能力達(dá)59.73%，此結(jié)果與最佳理論條件下所得的結(jié)果接近。

圖4 各因素對(duì)·OH清除率的影響Fig.4 Response surface plots for the interactive effects of different variables on the·OH scavenging activity

圖5 各因素對(duì)Fe2+螯合能力的影響Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of different variables on Fe2+chelating ability

2.4 魚(yú)鱗膠原蛋白酶解液與常用抗氧化劑之間的比較

魚(yú)鱗膠原蛋白酶解液與常用抗氧化劑之間的比較結(jié)果見(jiàn)表6。

如表6所示，魚(yú)鱗膠原蛋白酶解液在O2-·清除能力、·OH清除能力和Fe2＋螯合作用方面均高于未水解魚(yú)鱗膠原蛋白（P＜0.05）。O2-·清除率為 65.34%，未達(dá)到BHA及抗壞血酸的水平。而在·OH清除率和Fe2＋螯合作用方面達(dá)到（P＞0.05）或超過(guò)（P＜0.05）BHA及抗壞血酸的抗氧化活性。因此，魚(yú)鱗膠原蛋白酶解液是具有抗氧化潛力的多肽物質(zhì)。

表6 魚(yú)鱗膠原蛋白酶解液與常用抗氧化劑之間的比較結(jié)果Table 6 Comparison of antioxidant activities between scale collagen hydrolysate and common antioxidants

3 討論

近年來(lái)，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)酶水解影響因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得制備抗氧化多肽的最佳條件，取得了良好的效果。如Ren等[16]對(duì)草魚(yú)肌漿蛋白進(jìn)行酶解，通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，在酶與底物比例為0.79%、水解時(shí)間為5.69 h、反應(yīng)溫度在52.15℃的條件下，酶解產(chǎn)物的自由基清除率最高。Lin等[17]獲得了堿性蛋白酶制備抗氧化肽的最佳條件：底物濃度5.16%、酶用量2.37%和pH值為6.66時(shí)，水解產(chǎn)物的還原能力在700 nm時(shí)高達(dá)1.533。Wang等[18]通過(guò)酶水解和超濾法得到了分子量為10 kDa～30 kDa蛋清抗氧化肽，并利用Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法研究了脈沖電場(chǎng)處理參數(shù)對(duì)抗氧化活性的影響。Yang等[6]響應(yīng)面設(shè)計(jì)得出磷酸濃度為6.7%、底物濃度為50%、蒸煮時(shí)間為180 min時(shí)，DPPH自由基清除效率最高。Teng等[19]、Lin 等[17]、Fang 等[14]和 áLVAREZ 等[15]也通過(guò)響應(yīng)面法獲得了制備不同蛋白抗氧化肽的最優(yōu)條件。在本試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面法，通過(guò)測(cè)定O2-·、·OH清除率及Fe2＋的螯合能力，也得到了酶解魚(yú)鱗膠原蛋白的最佳工藝條件。

抗氧化劑可以通過(guò)螯合過(guò)渡金屬離子來(lái)抑制氧化的發(fā)生。其中，鐵離子對(duì)細(xì)胞中活性氧自由基的形成起關(guān)鍵作用，因此試驗(yàn)檢測(cè)了Fe2＋螯合能力[13]。結(jié)果表明，與常用抗壞血酸和BHA比，最優(yōu)條件下魚(yú)鱗膠原蛋白酶解液 Fe2＋螯合能力更強(qiáng)（P＜0.05），這可能是由于蛋白酶解使得肽鍵斷裂，自由氨基和羧基濃度的增加隔離了體系內(nèi)促氧化的金屬離子，從而提高了抗氧化效果。另一方面可能是由某些氨基酸殘基的暴露增加引起的，如組氨酸就具有金屬螯合能力。通過(guò)對(duì)魚(yú)鱗膠原蛋白質(zhì)的酶解，使具有金屬螯合能力的氨基酸殘基更多地暴露出來(lái)，增強(qiáng)了Fe2＋的螯合能力。

ESR檢測(cè)儀是測(cè)定自由基的最直接有效的重要工具，可以準(zhǔn)確地測(cè)定出物質(zhì)的抗氧化活性，因此，ESR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白多肽自由基測(cè)定試驗(yàn)中。Liu等[11]通過(guò)應(yīng)用ESR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，豬血漿蛋白水解物具有一定的O2-·、·OH、DPPH自由基的清除能力。Peng等[12]通過(guò)ESR儀測(cè)定了不同分子量范圍多肽自由基的清除能力，研究表明，分子量為0.1 kDa～2.8 kDa范圍的多肽自由基清除效果最好。本試驗(yàn)魚(yú)鱗膠原蛋白酶解液的自由基清除能力明顯高于未水解物（P＜0.05）。Sudhakar等[20]也研究表明，所得到的水解多肽具有較高的自由基清除效果。鰱魚(yú)鱗的胃蛋白酶水解物自由基清除活性最高，經(jīng)超濾后得到5個(gè)部分，利用ESR法發(fā)現(xiàn)，分子量＜1 kDa多肽部分的DPPH自由基、O2-·、·OH清除效果最佳，且可減輕H2O2誘導(dǎo)腸上皮Caco-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[21]。

越來(lái)越多的研究表明，蛋白酶解后，所得到的特定多肽段抗氧化效果更好。如Cai等[22]得到分子量分別為640.74、618.89 Da和484.56 Da的草魚(yú)皮多肽段，具有較強(qiáng)的·OH和DPPH自由基清除能力。Wang等[23]也證實(shí)，分子量為1 kDa和1 kDa～3 kDa的玉米蛋白多肽，具有提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的作用。Girgih等[24]水解大西洋鱈魚(yú)后，再利用膜過(guò)濾和反相液相色譜法將分子量小于1 kDa的部分繼續(xù)純化為四部分，其中三部分多肽組分具有較好的抗氧化效果。與之相似，盧素珍等[25]和Huang等[13]分別利用草魚(yú)鱗和尖吻鱸及鯔魚(yú)為原料，發(fā)現(xiàn)水解多肽的抗氧化效果要優(yōu)于未水解物。這可能是由于蛋白水解后，其致密結(jié)構(gòu)被破壞，從而使更多具有抗氧化能力的氨基酸殘基暴露，抗氧化效果增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，自由基清除作用可能是通過(guò)阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或螯合作用來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用的，小分子多肽可在溶液與溶質(zhì)界面或者固相與氣相界面形成薄膜，從而防止氧化的發(fā)生[12]。本試驗(yàn)也說(shuō)明，多肽的自由基清除能力和Fe2＋螯合能力對(duì)魚(yú)鱗蛋白多肽的抗氧化性起著重要作用。

4 結(jié)論

綜合響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及現(xiàn)實(shí)因素，確定魚(yú)鱗膠原蛋白實(shí)際水解工藝條件為酶解時(shí)間4.4 h、溫度66.0℃、pH8.5、底物濃度20 mg/mL、加酶量4%。此時(shí)酶液物的Fe2＋螯合能力、O2-·、·OH 清除率分別為59.73%、65.34%和80.24%，達(dá)到了響應(yīng)面最佳工藝效果。