劉輊彬 吳敏 吳小翠 韓敏 張青 沙巍

我國結核病尤其是耐藥結核病防控形勢依然嚴峻[1]，復治肺結核耐藥率遠高于初治肺結核[2-3]，從復治肺結核患者中快速檢出耐藥結核分枝桿菌，指導臨床選擇有效的抗結核藥物，制定合理的化療方案，是治療復治及耐藥結核病的關鍵[4]。目前，臨床廣泛應用的傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗(drug susceptibility testing，DST)耗時較長，不能為臨床提供時效性檢測結果[5-6]；分子DST在1～2 d內(nèi)即可報告結果，越來越受到重視。本研究采用PCR-反向點雜交法進行分子DST檢測，通過前瞻性隨機對照的方法，探討分子DST對復治涂陽肺結核患者化療的指導及效果。

對象和方法

一、研究對象

收集2016年3月至2020年1月上海市肺科醫(yī)院診治的400例復治涂陽肺結核患者作為研究對象，包括初治失敗、規(guī)則用藥滿療程后痰菌復陽、不規(guī)律化療超過1個月及慢性排菌的患者；排除就診前已接受耐多藥方案治療的患者，以及惡性腫瘤、HIV感染或艾滋病、長期使用激素或免疫抑制劑、妊娠或哺乳期的患者。本研究通過本院倫理審查委員會的審批，所有患者均簽署知情同意書。

所有患者均定期于我院住院或門診隨訪，收集每例患者的痰液或支氣管肺泡灌洗液，每份標本量不少于3 ml，經(jīng)涂片熒光染色鏡檢，收集抗酸桿菌陽性標本共400份。所有標本均行分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性且鑒定為MTB的分離株采用微孔板法進行表型DST，按就診時間順序依隨機數(shù)字表法對其中200例患者的同一份標本采用PCR-反向點雜交法進行分子DST。行PCR-反向點雜交法患者與未行PCR-反向點雜交法患者性別、年齡及復治類型的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，見表1。

表1 不同臨床特征在行PCR-反向點雜交法患者與未行PCR-反向點雜交法患者中的分布情況

二、研究方法

1.微孔板法DST：將涂片陽性標本經(jīng)N-乙酰左旋半胱氨酸-氫氧化鈉消化液處理15 min，加入磷酸鹽緩沖液至40 ml，4 ℃ 3000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入2 ml 磷酸鹽緩沖液振蕩重懸。取0.5 ml上述重懸液，按《結核病實驗室檢驗規(guī)程》[7]進行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株應用對硝基苯甲酸、噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基生長試驗進行菌種鑒定，鑒定為MTB的分離株采用美國賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)的分枝桿菌藥敏檢測板Sensititre?MYCOTB進行表型DST檢測，具體操作方法按照說明書進行，其中，異煙肼(H)和利福平(R)耐藥濃度分別為0.2 μg/ml和1 μg/ml。

2.PCR-反向點雜交法DST：取1 ml上述重懸液，應用亞能生物技術(深圳)有限公司的MTB耐藥突變基因檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法)檢測H耐藥相關基因katG的315位點和inhA的-15位點以及R耐藥相關基因rpoB的516、526、531位點，具體操作方法及結果判讀按照說明書進行，對陰性或無法判讀結果者采用PCR-反向點雜交法進行分枝桿菌菌種鑒定。

三、治療方案

培養(yǎng)或PCR-反向點雜交法鑒定為非結核分枝桿菌的患者按NTM肺病治療，其他患者治療方案如下：微孔板法結果回報前，PCR-反向點雜交法檢測為H和(或)R耐藥的患者予H和(或)R耐藥化療方案，其余患者予H、R敏感復治化療方案；微孔板法結果回報后，以微孔板法結果為標準調(diào)整化療方案?；煼桨傅闹贫ㄔ瓌t符合WHO和中國防癆協(xié)會制定的相關指南[3,8]。

四、 近期療效觀察指標及評價

化療方案中未調(diào)整H和(或)R的患者，于治療前、微孔板法結果回報時及治療3、6、9、12個月末，行痰抗酸桿菌涂片及分枝桿菌培養(yǎng)；化療方案中調(diào)整H和(或)R的患者，于治療前、微孔板法結果回報時及根據(jù)微孔板法結果調(diào)整化療方案后3、6、9、12個月末，行痰抗酸桿菌涂片及分枝桿菌培養(yǎng)。以痰菌陰轉(zhuǎn)率為評價近期療效的主要指標，按照中華醫(yī)學會《臨床診療指南結核病分冊》[9]制訂的標準，痰菌陰轉(zhuǎn)指連續(xù)2次痰涂片或培養(yǎng)陰性(至少間隔30 d)，且不再復陽。

五、統(tǒng)計學處理

結 果

一、微孔板法確診的利福平耐藥結核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)患者的臨床特征

微孔板法共確診RR-TB患者114例，58例行PCR-反向點雜交法患者與56例未行PCR-反向點雜交法患者治療前及本次治療的各項臨床特征的差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 不同臨床特征在微孔板法確診的利福平耐藥結核病患者中的分布情況

二、微孔板法結果回報時RR-TB患者中行PCR-反向點雜交法與未行PCR-反向點雜交法患者的痰涂片抗酸桿菌情況比較

微孔板法結果回報時，RR-TB患者中行PCR-反向點雜交法患者與未行PCR-反向點雜交法患者的痰涂片抗酸桿菌陰轉(zhuǎn)率分別為18.9%(10/53)和5.9%(3/51)，前者高于后者，差異有統(tǒng)計學意義；兩者痰涂片陽性標本抗酸桿菌分級計數(shù)分布存在差異，行PCR-反向點雜交法患者痰標本荷菌量更少，差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 微孔板法結果回報時利福平耐藥結核病患者的痰涂片抗酸桿菌鏡檢情況比較

三、應用利福平耐藥方案治療后RR-TB患者中行PCR-反向點雜交法與未行PCR-反向點雜交法患者的痰菌陰轉(zhuǎn)率比較

部分患者在部分時段中斷治療或因咳痰癥狀緩解導致無痰或無法獲得合格痰標本，能夠留取合格痰標本進行痰檢的RR-TB患者在應用利福平耐藥方案治療后的不同時間點痰涂片或培養(yǎng)的陰轉(zhuǎn)情況見表4。結果顯示，行PCR-反向點雜交法患者與未行PCR-反向點雜交法患者在應用利福平耐藥方案治療3、6、9、12個月末痰菌陰轉(zhuǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義。

表4 應用利福平耐藥方案治療后的不同時間點利福平耐藥結核病患者痰菌陰轉(zhuǎn)率的比較

討 論

結核病患者體內(nèi)通常敏感菌和耐藥菌并存，只是所占比例不同[10]，一般初治患者敏感菌比例高于耐藥菌，部分患者因各種原因由初治轉(zhuǎn)變?yōu)閺椭螘r，隨著敏感菌株被逐漸殺滅，耐藥菌株逐漸占優(yōu)勢，因此成為耐藥結核病高危人群。耐藥結核病發(fā)現(xiàn)的延遲和不精準的復治化療方案，不僅不利于復治結核病患者自身的早日康復，還可能導致患者對更多抗結核藥物發(fā)生耐藥以及耐藥MTB的進一步傳播[11]。近年來分子DST檢測技術的發(fā)展有助于解決上述問題。

Jeon等[12]報道了分子DST對耐多藥結核病治療起始時間的影響，研究發(fā)現(xiàn)復治、GeneXpert MTB/RIF和分子線性探針檢測是耐多藥結核病起始治療時間的獨立影響因素，復治結核病將推遲耐多藥結核病起始治療時間，而分子DST可使起始治療時間提前。本研究顯示，微孔板法確診的RR-TB患者中，行PCR-反向點雜交法的患者在微孔板法結果回報時，痰涂片抗酸桿菌陰轉(zhuǎn)率明顯上升，痰涂片陽性標本荷菌量明顯下降，提示行PCR-反向點雜交法的患者能在時間上更早獲得痰菌情況的改善，原因是PCR-反向點雜交法能更快發(fā)現(xiàn)耐藥，接受PCR-反向點雜交法指導制定化療方案的患者能更早啟動耐藥治療方案。

本研究顯示，微孔板法確診的RR-TB患者中行PCR-反向點雜交法者與未行PCR-反向點雜交法患者在應用利福平耐藥方案治療3、6、9、12個月末痰菌陰轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計學意義，提示兩者近期療效無差別。埃塞俄比亞的一項研究評價了耐藥結核病患者中基于基因型的診斷算法對治療啟動時間和治療結果的影響，研究發(fā)現(xiàn)GeneXpert MTB/RIF可通過快速診斷和治療啟動明顯緩解耐藥肺結核的傳播，其次是分子線性探針，特別是在涂片陽性的患者中；但是就治療結果而言，與基于固體培養(yǎng)的DST相比，3種檢測方法差異無統(tǒng)計學意義[13]。Shi等[14]報道，在中國江蘇和四川兩家醫(yī)院進行的一項隊列研究顯示，與未行分子DST檢測的對照組相比，MTBDRsl/MTBDRplus法DST檢測組耐多藥結核病診斷時間明顯縮短，痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時間更快，治療成功率更高。分子DST 指導的精準治療可以提高耐藥結核病患者的治療成功率。

分子DST 指導的精準治療不僅可以提高耐藥結核病患者的療效，還可以減少更多抗結核藥物發(fā)生耐藥及降低不良反應發(fā)生率。Romanowski等[15]的研究顯示，與痰涂片及GeneXpert MTB/RIF相比，分子線性探針對異煙肼耐藥、利福平敏感結核病的準確診斷和量身定制的治療使獲得性耐多藥結核病相對減少了近50%。另一項多中心開放隨機對照臨床研究在GeneXpert MTB/RIF 確診的RR-TB患者中通過快速培養(yǎng)獲得MTB分離株后，采用全基因組測序技術對吡嗪酰胺進行耐藥性檢測從而優(yōu)化超短程化療方案，結果顯示，開始治療后的84 周內(nèi)病情持續(xù)好轉(zhuǎn)且無反復，痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時間縮短，不良事件發(fā)生率下降[16]。

盡管分子DST以其快速、簡便、高效的優(yōu)點可以在耐藥結核病的早期診斷和化療方案的合理制定方面發(fā)揮重要作用，但是也要充分認識到不同抗結核藥物的分子DST可靠性不同，且不同分子DST檢測方法的敏感度和特異度也存在差異[17]。PCR-反向點雜交法是將高敏感度的PCR技術和高通量的反向點雜交技術相結合的基因檢測技術，已有研究報道該方法對復治涂陽肺結核患者的臨床標本中MTB的H、R耐藥性具有較好的檢測效能[18]。但本研究中，PCR-反向點雜交法對微孔板法確診的單耐H結核病的敏感度較低，故本研究未對微孔板法確診的單耐H肺結核患者的療效進行分析。因此，目前在分子DST和表型DST均無法滿足臨床既要保證較高敏感度又要兼顧時效性的實際需求的情況下，建議聯(lián)合檢測以保障耐藥結核病高危人群獲得更大的收益。

本研究的局限在于PCR-反向點雜交法敏感度不夠高且存在假陽性現(xiàn)象，未對肺部影像學變化及遠期療效進行觀察及評價。未來將選擇敏感度和特異度更高的分子生物學方法或多種分子生物學方法聯(lián)合檢測；另外，要進一步擴大樣本量，觀察及評價肺部影像學變化和遠期療效；開展其他抗結核藥物特別是二線核心藥物的分子DST檢測。