鄧先清,朱明輝,謝 權(quán),朱洋女,朱明明,宋明霞
(1.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部,江西,吉安 343009;2.井岡山大學(xué)中藥資源和功能分子研究中心,江西,吉安 343009)
隨著細(xì)菌對(duì)越來越多的藥物產(chǎn)生耐藥,多重耐藥菌的感染導(dǎo)致越來越高的患者發(fā)病率和死亡率,細(xì)菌耐藥性問題日益威脅人類健康[1]。面對(duì)細(xì)菌的耐藥和新病原菌出現(xiàn)及其導(dǎo)致的嚴(yán)重狀況,需要通過不斷探索、發(fā)現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)摸索去研制結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特有效的抗菌藥物。我國(guó)擁有極其豐富的天然藥用資源,從中尋找高效低毒的抗菌藥物將會(huì)是解決細(xì)菌耐藥問題的有效途徑[2-4]。
陸英(Sambucus chinensis Lindl.)是忍冬科植物,又被稱作接骨草、八棱麻、走馬風(fēng)等,多年生草本植物,分布于我國(guó)大部分地區(qū),資源豐富。陸英始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[5],味甘、酸、性溫,以根、莖及葉入藥,具有散瘀消腫、祛風(fēng)活絡(luò)、去濕止痛等功效[6-7],在民間,因具有接骨功能而得名接骨草,現(xiàn)廣泛用于跌打損傷、骨折疼痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等。
陸英針劑可用于治療急性菌痢、急性化膿性扁桃腺炎、多發(fā)性癤腫等炎癥,因而具有一定抗菌消炎作用[8]?,F(xiàn)代藥理研究證實(shí)陸英具有抗炎鎮(zhèn)痛作用,其根莖葉水提液灌胃給藥對(duì)急性炎癥有明顯抑制作用,對(duì)物理性和炎性疼痛也具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[9-10]。陸英化學(xué)成分主要含三萜類物質(zhì),如伊香樹脂醇、香樹酯醇、齊墩果酸、烏索酸等。近年大量文獻(xiàn)報(bào)道了三萜酸類成分較強(qiáng)的藥理活性,如抗肝炎[11]、降血糖[12]、抗病毒[13]等活性,且陸英作為臨床上的常用藥,已廣泛用于急性病毒性肝炎、消炎等,但目前其抗菌作用有效部位及抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)的研究尚未見報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)擬系統(tǒng)研究陸英提取物的體外抗菌活性,獲得其對(duì)臨床常見普通菌株和耐藥菌株的MIC值,并基于陸英的主要成分和物質(zhì)基礎(chǔ),對(duì)其抗菌活性部位進(jìn)行追蹤,獲得其有效部位。通過比較不同提取方式對(duì)抗菌活性成分的提取優(yōu)劣,確定陸英抗菌活性成分的有效提取方式,為后續(xù)抑菌中藥的開發(fā)及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)[14]。
KXQ-LS 高壓滅菌儀(上海博訊有限公司),GRP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),HZQ-F100 全溫振蕩培養(yǎng)箱(江蘇太倉(cāng)市華美生化儀器廠),SW-CJ-2D 型雙人單面凈化工作臺(tái)(普通型,蘇州凈化設(shè)備有限公司),iMark 酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000(上海亞榮生化儀器廠),HM-701 超微粉碎機(jī)(北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司),SL-250 型超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司),ZNHW 型電熱套(上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司),WT30001B 電子天平(常州萬泰天平儀器有限公司)。
陸英采自江西吉安,由井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部周秋貴副教授鑒定;培養(yǎng)基(英國(guó)OXOID 公司,500 g makes 38.4 litres),BHI 培養(yǎng)基(英國(guó)OXOID 公司,500 g makes 13.5 Litres),二甲亞砜(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純AR 500 mL),G116212 甘油(阿拉丁試劑公司,500 mL);十三種常見菌:革蘭氏陽性軍金葡萄球菌CMCC(B) 26003 和CMCC 25923、枯草芽孢桿菌CMCC 63501、糞腸球菌CMCC 29212、變異鏈球菌BNCC 336931、耐藥金葡萄球菌ATCC 33591 和ATCC 43300、革蘭氏陰性菌大腸桿菌CMCC 44568 和CMCC 25922、銅綠假單胞菌CMCC 10104 和CMCC 27853 以及耐藥銅綠假單胞菌ATCC BAA-2111、大腸桿菌ATCC BAA-196,以上菌種是從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、北納生物科技有限公司和美國(guó)ATCC 菌種保藏中心采購(gòu)得到。
1.3.1 陸英不同溶劑提取物的制備
1.3.1.1 甲醇超聲法
將干燥陸英粉碎,稱藥末50 g,50 ℃下用90%的甲醇(料液比=1:10(m/v))超聲提取1 h,連續(xù)3 次,合并3 次提取液減壓濃縮成浸膏。稱取0.25 g粗提物浸膏于離心管中備用。剩余浸膏按1:10(m/v)溶于水中,再分別用1:20(m/v)的石油醚、乙酸乙酯萃取3 次,合并萃取液,得石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、水相萃取物,濃縮溶劑后得到各相浸膏。
1.3.1.2 乙醇熱回流法
稱取陸英藥粉50 g,用75% 乙醇按料液比1:10(m/v)于圓底燒瓶中加熱回流1 h,過濾,濾渣再重復(fù)操作2 次,合并3 次濾液,減壓濃縮成浸膏。稱取0.25 g 的粗提物浸膏于離心管中備用。剩余的浸膏按1:10(m/v)溶于水中,再依次用1:20(m/v)的石油醚、乙酸乙酯萃取3 次,合并萃取液,得石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、水相萃取物,濃縮溶劑后得到各相浸膏[15]。
1.3.2 抗菌實(shí)驗(yàn)
1.3.2.1 藥液制備
將兩種提取方法得到的0.25 g 粗體浸膏和石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、水相萃取物浸膏溶于0.5 mL 二甲基亞砜(DMSO)中,得到濃度為0.5 g/mL 的各部位藥液,放在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2.2 抗菌活性評(píng)價(jià)
1.3.2.2.1 初篩
將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌種用培養(yǎng)基稀釋成105CFU/mL濃度備用。96 孔培養(yǎng)板中,每孔加入100μL 培養(yǎng)液、4 μL藥液和100 μL菌液,使藥液最終濃度為10 mg/mL。37℃下, 在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用酶標(biāo)儀在650 nm測(cè)吸光度, 根據(jù)培養(yǎng)前后吸光度的變化最后計(jì)算得到抑制率。若化合物抑制率大于75%,則選出進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
如表1 所示,乙醇回流法的提取率要明顯高于甲醇超聲法,說明溫度高低對(duì)其藥物物質(zhì)的溶出影響更大,加熱更有利藥材中各類成分的溶出。從陸英粗提物各萃取相的提取含量中可以看出,萃取后乙酸乙酯萃取相含量都是最少的,水相是最多的,石油醚相居中,且乙醇回流方法得到的各萃取相的成分含量都比甲醇超聲法要多。
表1 兩種提取方法的提取率比較(%)aTable1 Comparison of extraction rates for two extraction methods(%)
如表2 所示,實(shí)驗(yàn)選取了圖表中這些常見革蘭氏陽性菌、陰性菌和幾個(gè)耐藥菌進(jìn)行活性測(cè)定,兩種不同提取方式所得粗提物對(duì)大多數(shù)所選菌株在10 mg/mL 劑量下表現(xiàn)抗菌活性,但對(duì)變異鏈球菌BNCC 336931 和大腸桿菌CMCC 44568 未表現(xiàn)出抗菌活性。比較兩種提取法獲得粗提物的活性,發(fā)現(xiàn)甲醇超聲法提取物對(duì)一些菌株的抗菌活性要強(qiáng)于乙醇回流法,前者對(duì)金葡菌CMCC 26003、CMCC 25923 和枯草芽孢桿菌CMCC 63501 的活性要比后者高8 倍,對(duì)枯草芽孢桿菌CMCC 63501 菌株的抗菌MIC 值達(dá)到0.625 mg/mL。
表2 不同提取方法獲得粗提物的抑菌活性比較(MIC 值,mg/mL)Table 2 Comparison of antibacterial activity of two crude extracts
通過將兩種提取方式所得粗提物依次進(jìn)行石油醚、乙酸乙酯和水萃取,分別得到石油醚相、乙酸乙相和水相。如表3 所示,石油醚萃取相對(duì)常見革蘭氏陽性菌都具有不同程度的抑菌活性;乙酸乙酯和水相對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌也表現(xiàn)出較好的抗菌活性,但對(duì)糞腸球菌CMCC 29212和變異鏈球菌BNCC 336931 的抗菌活性較弱。從不同菌株的敏感性來看,金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌對(duì)陸英有效成分更為敏感。從兩種提取方法來比較,甲醇法的萃取物抗菌活性都比乙醇法的萃取物更好,尤其是前者,其石油醚萃取相對(duì)金葡菌CMCC 26003 和枯草芽孢桿菌CMCC 63501 的MIC值達(dá)到了0.625 mg/ml。因此甲醇提取的石油醚相是陽性菌有效成分的活性部位。
表3 各萃取相對(duì)革蘭氏陽性菌的MIC 值(mg/mL)Table 3 Antibacterial activity of different crude extracts against Gram-positive bacteria
表4 為各萃取相對(duì)常見陰性菌的抑菌活性結(jié)果。兩種提取方法的水相在10 mg/mL 濃度下都未見抗菌活性,甲醇提取法的石油醚相和乙酸乙酯相對(duì)各種陰性菌均有活性,MIC 值大多為10 mg/mL。乙醇提取法的石油醚相比乙酸乙酯相要好,前者對(duì)大腸桿菌CMCC 44568、CMCC 25922 和銅綠假單胞菌CMCC 27853 在10 mg/mL 濃度下表現(xiàn)出活性,而后者僅對(duì)大腸桿菌25922 表現(xiàn)出抗菌活性。
表4 各萃取相對(duì)革蘭氏陰性菌的MIC 值(mg/mL)Table 4 Antibacterial activity of different extracts of two crude extracts against resistant bacteria
表5 為各萃取相對(duì)幾個(gè)耐藥菌的抑菌活性結(jié)果。兩種提取方法的水相萃取物只對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌ATCC 43300 顯示出抗菌活性(MIC=5.0 mg/mL),對(duì)另外幾種耐藥菌則在10 mg/mL 濃度下未表現(xiàn)抑菌活性。而石油醚和乙酸乙酯萃相則對(duì)各耐藥菌株都顯現(xiàn)出了良好的抑制活性。其中,耐藥性金黃色葡萄球菌對(duì)陸英活性成分更為敏感,甲醇超聲法的石油醚相的對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌ATCC 33591 和43300 的MIC 分別達(dá)到1.25、0.625 mg/mL。此外,乙醇提取法的石油醚相對(duì)ATCC 33591 的MIC 也達(dá)到1.25 mg/mL,表現(xiàn)較強(qiáng)抗菌活性。萃取物對(duì)于耐藥性革蘭氏陰性菌活性弱一些,石油醚相和乙酸乙酯相的抑菌MIC 在5~10 mg/mL。
表5 各萃取相對(duì)耐藥菌的抗菌活性MIC 值(mg/mL)Table 5 Antibacterial activity of different extracts of two crude extracts against resistant bacteria
陸英作為一種臨床常見的中草藥,在疏肝健脾、活血散瘀方面具有廣泛應(yīng)用。其抗肝炎的突出作用尤為引人關(guān)注,而其在抗菌等方面的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究還處在起步階段。本研究通過探究陸英對(duì)不同菌株的抗菌活性,以及其提取方法和抗菌有效部位,不僅促進(jìn)了陸英的全面開發(fā),也拓寬了中草藥抗菌的研究途徑。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)陸英對(duì)于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都表現(xiàn)出很好的抑制活性,尤其對(duì)前者抑制活性更強(qiáng)。從提取方法而言,陸英乙醇回流提取能夠獲得更多的提取物,但該提取物的抗菌活性要低于甲醇超聲提取法得到的提取物,兩者對(duì)金葡菌的活性相差8 倍。說明甲醇超聲更有利于抗菌活性成分的溶出。通過比較不同萃取部位的抗菌活性,確定了石油醚相作為陸英的抗菌活性部位,說明抗菌有效成分大多分布在該相。這一點(diǎn)與已報(bào)道的大多數(shù)抗菌中草藥不同。大多數(shù)植物的抗菌活性來源于黃酮類化合物,后者的極性較大,易被乙醚或者乙酸乙酯萃取,而陸英中已報(bào)道的綠原酸等抗菌物質(zhì)同樣極性較大,不易被石油醚萃取。本研究發(fā)現(xiàn)陸英抗菌活性有效部位是石油醚層,說明該藥中可能含有其他未見報(bào)道的小極性抗菌化學(xué)成分,這對(duì)于新的抗菌藥物研究具有重要意義,也對(duì)陸英抗菌的深入研究葉提供了科學(xué)依據(jù)。