莫美周， 王俐敏， 王瓊琳

1.澄邁縣中醫(yī)院 腦病科，海南 澄邁 571900；2.海南省中醫(yī)院 腦病科，海南 ?？?570000

缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)已成為我國成年人死亡和致殘的主要原因之一[1]。冠心病和CIS有許多共同的病理生理學(xué)機(jī)制，如二者均與血管功能障礙、動脈粥樣硬化有關(guān)[2]。已知表觀遺傳因素參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展，如人類染色體9p21(chromosome 9p21，Chr9p21)變異體是冠心病的強(qiáng)大遺傳標(biāo)記，該區(qū)域不含蛋白質(zhì)編碼基因，而是轉(zhuǎn)錄反義非編碼RNA。與Chr9p21位點較接近的蛋白質(zhì)編碼基因是周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN)2A和CDKN2B，其均參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。Chr9p21位點基因突變會誘導(dǎo)CDKN2A/2B基因5′啟動子區(qū)域甲基化，使轉(zhuǎn)錄沉默，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展。Ferreira等[3]研究顯示，CDKN2B-AS1基因rs2383207位點多態(tài)性與巴西人群大動脈粥樣硬化CIS的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)。Bayoglu等[4]研究亦表明，CDKN2B-AS1的幾個變異體亦可能導(dǎo)致高血壓患者收縮壓水平升高。然而，目前關(guān)于CDKN2A、CDKN2B基因表觀遺傳學(xué)改變與CIS發(fā)生關(guān)系的研究較少。因此，本研究旨在探討CDKN2A、CDKN2B基因啟動子甲基化狀態(tài)是否能夠預(yù)測中國人群原發(fā)性高血壓患者CIS的發(fā)生風(fēng)險?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2019年1月至2020年10月在澄邁縣中醫(yī)院高血壓管理信息系統(tǒng)中登記的302例原發(fā)性高血壓患者(高血壓組)與158例原發(fā)性高血壓合并CIS患者(合并CIS組)為研究對象。根據(jù)世界衛(wèi)生組織關(guān)于CIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，通過臨床評估和神經(jīng)影像學(xué)[腦部磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)和(或)頭顱X線計算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)]對CIS進(jìn)行診斷。高血壓通過收縮壓(systolic blood pressure，SBP)≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或(和)舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)≥90 mmHg或病例報告中存在高血壓病史且服用抗高血壓藥物確診。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥20歲的漢族人群；(2)在當(dāng)?shù)赜?0年以上的居住史。排除繼發(fā)性高血壓、心血管疾病史、合并感染、惡性腫瘤、肝腎功能嚴(yán)重障礙、自身免疫性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 一般資料 收集患者一般資料，包括年齡、性別、種族、吸煙史(平均吸煙天數(shù)≥1 d、吸煙時間>1年，定義為吸煙)、飲酒史(平均每周飲酒3次，每次超過50 g，定義為飲酒)、疾病史等，記錄患者的血壓、體質(zhì)量指數(shù)、腰圍和臀圍。通過標(biāo)準(zhǔn)的水銀血壓計測量患者右臂的SBP和DBP。腰圍和臀圍用不可伸縮的人體測量膠帶測量，患者站直，雙腳并攏，雙臂放在身體兩側(cè)。生化檢測包括血尿酸(uric acid，UA)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)和隨機(jī)血糖(glucose，Glu)。使用日立7080全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)對所有生物指標(biāo)的水平進(jìn)行量化。

1.2.2 CDKN2A、CDKN2B基因甲基化水平檢測 在隔夜禁食后，于清晨抽取外周靜脈血樣進(jìn)行生化參數(shù)測定和表觀基因分型。基因組DNA是采用全血基因組DNA提取試劑盒(美國Zymo Research公司)從全血中提取的。DNA被定量后稀釋到10 ng/μl工作濃度。選擇CDKN2A/2B基因啟動子近端的CpG島[篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1)最小長度200 bp；(2)GC含量≥50%；(3)CpG-雙核苷酸比值≥0.60]。從CDKN2A的CpG島上篩選出6個區(qū)域，從CDKN2B的CpG島上篩選出3個區(qū)域進(jìn)行測序(圖1)。采用亞硫酸鹽擴(kuò)增子高通量測序法(bisulfite amplicon sequencing，BSAS)進(jìn)行定量甲基化分析。取1 μg DNA樣本用EZ DNA Methylation-Gold試劑盒(美國Zymo Research公司)進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。對目的CpG區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在Illumina MiSeq Benchtop測序儀上測序。所有樣本的平均覆蓋率均>600倍。每個CpG位點的甲基化水平被計算為甲基化C占區(qū)域內(nèi)所有覆蓋到C位點的比例。用于PCR的引物序列。見表1。

表1 CDKN2A/2B基因各位點的引物序列

圖1 CDKN2A/2B基因啟動子周圍CpG區(qū)域序列測定

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較 兩組患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、腰圍、臀圍、吸煙史、糖尿病史、SBP、DBP、UA、TG、HDL、Glu、CDKN2A甲基化水平等方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；合并CIS組患者飲酒史比例、Hcy、TC、LDL、CDKN2B甲基化水平均高于高血壓組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者的一般資料比較

2.2 CDKN2B基因甲基化水平與CIS的關(guān)系 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，飲酒史、血清Hcy和LDL水平升高以及CDKN2B基因啟動子甲基化是高血壓患者發(fā)生CIS的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。另外，根據(jù)性別對患者進(jìn)行分層，在調(diào)整飲酒史、Hcy、TC、LDL等變量后，無論是男性還是女性患者，CDKN2B基因啟動子甲基化均是CIS發(fā)生的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸模型分析CDKN2B基因甲基化水平與CIS的相關(guān)性

2.3 CDKN2B基因甲基化水平與高血壓患者年齡的關(guān)系 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，對于原發(fā)性高血壓患者，CDKN2B基因甲基化水平與患者年齡呈正相關(guān)性(rs=0.178，P<0.05)。見圖2。

圖2 Spearman相關(guān)性分析原發(fā)性高血壓患者CDKN2B基因甲基化水平與年齡的關(guān)系

2.4 ROC曲線分析CDKN2B基因甲基化水平預(yù)測高血壓患者繼發(fā)CIS的臨床價值 CDKN2B基因甲基化水平預(yù)測高血壓患者繼發(fā)CIS的ROC曲線下面積為0.677(95%可信區(qū)間0.589～0.779)。另外，對男性和女性患者CIS發(fā)生風(fēng)險的預(yù)測曲線下面積分別為0.603(95%可信區(qū)間0.527～0.678)和0.754(95%可信區(qū)間0.693～0.815)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.579，P<0.05)。見圖3。

圖3 CDKN2B基因甲基化水平預(yù)測高血壓患者CIS發(fā)病風(fēng)險的ROC曲線

3 討論

CIS是一種受多因素影響且涉及多基因的復(fù)雜疾病[6-7]。然而，遺傳因素，尤其是基因間的相互作用，仍有待進(jìn)一步闡明。本研究通過對Chr9p21位點附近兩個相關(guān)蛋白質(zhì)編碼基因CDKN2A和CDKN2B進(jìn)行啟動子甲基化水平分析，發(fā)現(xiàn)高血壓合并CIS患者CDKN2B基因普遍呈高甲基化水平，且這亦是高血壓患者發(fā)生CIS的獨(dú)立危險因素之一。

頸動脈和(或)腦動脈粥樣硬化性狹窄約占CIS的30%，隨著內(nèi)頸動脈狹窄程度的增加，CIS的發(fā)生風(fēng)險也逐漸加大[8]?；蛞蛩卦贑IS的發(fā)病中起重要作用，研究基因-CIS的關(guān)系，對預(yù)防CIS的發(fā)生有十分重要的臨床價值。CDKN2A和CDKN2B編碼基因均位于人類染色體9p21上，在全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWASs)中發(fā)現(xiàn)，CDKN2B-AS1基因含有多種冠狀動脈疾病的遺傳標(biāo)記[9]。一些Chr9p21變異體可上調(diào)INK4基因座中反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)的表達(dá)，ANRIL可招募和結(jié)合表觀遺傳修飾因子，如多梳阻遏復(fù)合物到相鄰基因的啟動子區(qū)，從而影響CDKN2A和CDKN2B基因DNA甲基化修飾，甲基化多發(fā)生在啟動子區(qū)域周圍的CpG島上，通常會抑制該基因的表達(dá)[10]。CDKN2B作為腫瘤抑制基因，通過視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)途徑參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[11]。CDKN2B編碼的p15INK4b蛋白，能特異性結(jié)合CDKN4和CDKN6，導(dǎo)致細(xì)胞G1期阻滯，阻斷細(xì)胞增殖[12]。CDKN2B甲基化可能導(dǎo)致無限制的細(xì)胞增殖的觀點已經(jīng)在一系列癌癥中得到證實。

在促鈣化和抑制鈣化失衡時，一定比例的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)傾向于轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞樣表型[13]。這些過程在動脈鈣化的進(jìn)程中起重要作用。因此，CDKN2B的甲基化可能是導(dǎo)致動脈鈣化的重要因素[14]。而血管鈣化是動脈粥樣硬化普遍存在的病理過程，是其主要標(biāo)志之一，亦是動脈粥樣硬化的必然結(jié)果[15]。動脈粥樣硬化斑塊是冠心病和CIS發(fā)病的主要病變基礎(chǔ)，是由血管平滑肌和巨噬細(xì)胞過度增殖所致[16]。CDKN2B-AS1轉(zhuǎn)錄體水平與動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度相關(guān)，而在小鼠動脈粥樣硬化模型中發(fā)現(xiàn)，阻斷CDKN2B基因表達(dá)后，可通過影響胞吐作用，增加負(fù)載脂質(zhì)壞死核的大小和復(fù)雜性，促進(jìn)脂質(zhì)積累，加速動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展[17-18]。抑制CDKN2B表達(dá)可能導(dǎo)致RB蛋白表達(dá)失去控制，這可能與隨后巨噬細(xì)胞的異常增殖有關(guān)。Lasek-Bal等[19]研究證實，CDKN2B-AS1基因rs4977574和rs7857345位點多態(tài)性與動脈粥樣硬化性卒中易感性之間存在顯著關(guān)聯(lián)。另外，高血壓是CIS發(fā)生的獨(dú)立高危因素之一，Bayoglu等[4]研究表明，CDKN2B基因rs10757274、rs2383207、rs10757278和rs1333049位點多態(tài)性均與高血壓有關(guān)。長鏈非編碼RNA可以在其目標(biāo)基因的啟動子區(qū)域形成RNA-DNA三聚體，從而發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，中國人群中CDKN2B基因甲基化水平與CIS患者主動脈弓鈣化有關(guān)，與無主動脈弓鈣化患者相比較，主動脈弓鈣化患者CDKN2B甲基化水平更高(P<0.001)。在本研究中，高血壓合并CIS患者CDKN2B基因甲基化水平普遍高于單純高血壓組患者，且校正一些混雜因素后，經(jīng)Logistic回歸分析，CDKN2B基因高甲基化是高血壓人群CIS發(fā)生的獨(dú)立危險因素之一。

年齡是原發(fā)性高血壓患者CIS發(fā)生的危險因素之一[21]，雖然本研究中兩組患者年齡水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，CDKN2B基因甲基化水平隨著年齡的增長而增加，兩者表現(xiàn)出較弱的相關(guān)性。這說明，年齡因素可能會影響CDKN2B基因甲基化水平，進(jìn)而導(dǎo)致與年齡有關(guān)的疾病。鄭中華等[22]研究在社區(qū)人群中并未發(fā)現(xiàn)CDKN2B基因甲基化水平與男性、女性以及總體人群年齡的關(guān)系。這可能與納入人群不同有關(guān)。另外，在本研究中，通過性別分層分析，CDKN2B基因甲基化水平在男性和女性高血壓患者中，對于預(yù)測CIS發(fā)病風(fēng)險有一定的差異，這說明，DNA甲基化水平亦可能受性激素影響。

綜上所述，高血壓合并CIS患者普遍存在CDKN2B基因高甲基化水平，其可以作為一個有效預(yù)測CIS發(fā)病風(fēng)險的分子標(biāo)志物。但本研究亦存在一定的局限性，如這是一個病例對照研究，因果關(guān)系不能被證實；其次，CDKN2B基因啟動子甲基化的具體機(jī)制尚不清楚；此外，未檢測編碼的蛋白水平。