◎ 馮俊富，朱飛如，余開科，駱海春

（北海市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 北海 536000）

根據(jù)我國(guó)食品衛(wèi)生法（1995年）的規(guī)定，食品添加劑是為改善食品色、香、味等品質(zhì)，以及為防腐和加工工藝的需要而添加到食品中的人工合成或天然物質(zhì)。目前我國(guó)食品添加劑有23個(gè)類別，2 000多個(gè)品種，包括酸度調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、漂白劑、膨松劑、著色劑、護(hù)色劑、增味劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、防腐劑、甜味劑和增稠劑等[1]。其中防腐劑和甜味劑在目前食品加工過(guò)程中應(yīng)用廣泛[2]。

隨著時(shí)代的發(fā)展，飲料行業(yè)是我國(guó)發(fā)展最快的行業(yè)之一，飲料數(shù)量和品種不斷增加，食品添加劑對(duì)推動(dòng)飲料市場(chǎng)發(fā)展起著重要作用[3]。為抑制微生物的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)飲料的貨架期，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸常作為防腐劑添加在飲料中[4]。糖精鈉是食品工業(yè)中常用的合成甜味劑，糖精鈉的甜度比蔗糖甜300～500倍，且提供的熱量較低，亦受到人們的青睞[5]。甜味劑和防腐劑多以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)有機(jī)反應(yīng)化合而成，其本身不能向人體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，大多具有一定的毒性，甚至在人體內(nèi)可能轉(zhuǎn)換成致癌物質(zhì)。在其生產(chǎn)過(guò)程中還有可能混入砷、鉛等重金屬[6]?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）對(duì)食品添加劑使用含量以及范圍均有嚴(yán)格限制[7]。近年來(lái)，隨著食品工業(yè)快速發(fā)展，食品質(zhì)量問(wèn)題越來(lái)越突出，尤其是在食品加工中，超量或違規(guī)使用添加劑現(xiàn)象屢禁不止[8]。隨著飲料品種和添加劑種類的日益增多，存在食品添加劑濫用的趨勢(shì)，對(duì)人體健康造成一定的風(fēng)險(xiǎn)。為保障食品安全，需要對(duì)飲料中食品添加劑的含量進(jìn)行檢測(cè)。目前參照的標(biāo)準(zhǔn)包括《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB/T 5009.28—2016）[9]、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）[10]。近年來(lái)，有關(guān)食品添加劑的檢測(cè)方法研究報(bào)道層出不窮，在檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度方面有所提高。敬小麗等[11]建立飲料中苯甲酸、山梨酸鉀2種防腐劑同時(shí)檢測(cè)的高效液相色譜法，牟霄等[12]采用超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飲料中14種食品添加劑，張劍峰等[13]采用超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飲料中的山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、糖精鈉和安賽蜜。

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)食品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉的檢測(cè)方法較多，本研究對(duì)高效液相色譜法測(cè)定苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉的檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相種類及pH等檢測(cè)條件進(jìn)行摸索研究，以便為4種添加劑的同時(shí)檢測(cè)提供更簡(jiǎn)便易行的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；XA205DU電子天平[MAX 81 g/220 g，d=0.01 mg/0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.1.2 試劑與樣品

甲醇（色譜純，美國(guó)Merck公司）；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；水中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（A2007199，1 000 μg·mL-1，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；脫氫乙酸（C0008887，99.9%，BePure）。

20批不同廠家飲料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：ACE Excel 5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流動(dòng)相A：0.02 mol·L-1乙酸銨（用氨水調(diào)pH=7.5），流動(dòng)相B：甲醇，A∶B=95∶5（V∶V）。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品0.050 48 g于50 mL容量瓶中，加5 mL氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解后，加水稀釋至刻度，搖勻，作為脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別準(zhǔn)確吸取水中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1）和脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。隨后以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液為基體逐級(jí)稀釋得混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉濃度為0 μg·mL-1、1 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1；脫氫乙酸濃度為0 μg·mL-1、1.009 μg·mL-1、2.017 μg·mL-1、5.043 μg·mL-1、10.086 μg·mL-1、20.172 μg·mL-1、50.430 μg·mL-1、100.859 μg·mL-1的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

樣品充分混勻，精密稱取樣品2.00 g，加水約20 mL，超聲提取20 min，冷卻至室溫，用水定容至25 mL，搖勻，過(guò)濾。

1.2.4 空白溶液的制備

除未加樣品外，其他照1.2.3操作制備，作為空白溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

有文獻(xiàn)報(bào)道苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉檢測(cè)所用的流動(dòng)相有甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（5∶95）[14]，甲醇和磷酸二氫銨（100 mmol·L-1）梯度洗脫[12]；乙腈-20 mmol·L-1磷酸二氫鉀[15]，甲醇和乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）梯度洗脫[16-18]；甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（7∶93）[19]，乙腈和乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）梯度洗脫[20]；甲醇與乙酸銨-無(wú)水硫酸鈉-三氟乙酸混合液（28∶72）[21]，甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（10∶90）梯度洗脫[22-23]。

從以上文獻(xiàn)可知，對(duì)流動(dòng)相選擇較多的是甲醇-0.02 mol·L-1乙 酸 銨 系 統(tǒng)，GB 5009.28—2016和GB 5009.121—2016中 也 采 用 了 甲 醇-0.02 mol·L-1乙酸銨系統(tǒng)，基于實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性以及對(duì)色譜柱、檢測(cè)器和實(shí)驗(yàn)人員的保護(hù)考慮，本研究流動(dòng)相選用甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨系統(tǒng)。

2.1.2 流動(dòng)相pH的選擇

通過(guò)考察0.02 mol·L-1乙酸銨的pH值，將0.02 mol·L-1的乙酸銨調(diào)節(jié)pH值為6.0、6.5、7.5、8.0和未調(diào)節(jié)pH值，以0.02 mol·L-1的乙酸銨∶甲醇（95∶5）分別進(jìn)樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值為7.5時(shí)，分離度較好，故選擇pH值為7.5的乙酸銨。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm下對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)苯甲酸在224 nm處有最大吸收，如圖1所示；山梨酸在254 nm處有最大吸收，如圖2所示；脫氫乙酸在230 nm處有最大吸收，如圖3所示；糖精鈉在204 nm處有最大吸收，如圖4所示；根據(jù)各目標(biāo)物紫外光譜圖，綜合考慮選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 苯甲酸紫外光譜圖

圖2 山梨酸紫外光譜圖

圖3 脫氫乙酸紫外光譜圖

圖4 糖精鈉紫外光譜圖

2.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、供試品溶液、空白溶液色譜圖分別見圖5、圖6、圖7，結(jié)果表明，空白溶劑在目標(biāo)物出峰處無(wú)雜質(zhì)干擾，目標(biāo)物之間分離度良好。

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖

圖6 供試品溶液色譜圖

圖7 空白溶液色譜圖

2.3 線性范圍和靈敏度

在1.2.1項(xiàng)的色譜條件下，對(duì)苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，在0～100 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表1。結(jié)果表明，本方法檢出限和定量限均小于GB 5009.28—2016和GB 5009.121—2016中的限量，靈敏度較高。

表1 4種添加劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

添加10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白飲料樣品按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，6次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表2，結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

表2 4種添加劑的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取空白飲料樣品，分別精密加入水中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1）和脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.05 mL、0.25 mL、0.50 mL依法提取，3個(gè)濃度水平的溶液各3份，按1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，其回收率見表3，結(jié)果表明回收率良好。

表3 4種添加劑加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=3）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

選擇20批飲料按1.2方法進(jìn)行檢測(cè)，其中有10批未檢出，10批檢出苯甲酸或山梨酸，結(jié)果見表4。

表4 實(shí)際樣品檢測(cè)含量表（單位：mg·kg-1）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)方法建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飲料中的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉，此方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，可為同時(shí)檢測(cè)飲料中的4種食品添加劑提供參考。