呂 茹，裴 碩，樊芳芳，張 濰，冉博文，胡曉蕓

研究表明，吸煙可造成血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)血小板的聚集與黏附，是動靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。組織纖溶酶原激活劑(t-PA)和纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)是纖溶系統(tǒng)的一對重要的調(diào)節(jié)因子，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。尼古丁為香煙煙霧的主要有害物質(zhì)之一，本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，尼古丁通過打破內(nèi)皮細(xì)胞t-PA/PAI-1的動態(tài)平衡，增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[2]。蛋白激酶-α(PKC-α)是細(xì)胞內(nèi)重要的生物信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，屬PKC亞型中的鈣離子依賴型或經(jīng)典型。PKC激活是血管內(nèi)皮功能紊亂的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[3]，但不同刺激物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1活化其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不盡相同，PKC-α信號通路是否在尼古丁誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能紊亂中發(fā)揮作用有待證實(shí)。本研究通過尼古丁及PKC抑制劑Staurosporine(STS)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，觀察各組細(xì)胞PAI-1的表達(dá)變化及伴隨的PKC-α通道蛋白的變化，探討吸煙引起內(nèi)皮細(xì)胞纖溶紊亂的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑 HUVECs細(xì)胞株購自上海門堞塔生物科技發(fā)展有限公司，為ATCC來源細(xì)胞株。尼古丁、STS均購自美國Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司。PAI-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)公司。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)引物、內(nèi)參照GAPDH引物由上海生工生物工程公司合成。Trizol RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。β-actin抗體、小鼠PKC-α單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自美國Santa Cruz公司。熒光FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 HUVECs的培養(yǎng)與分組 用10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，隔日換液1次，待細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2傳代，將傳代后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將生長良好的HUVECs傳代后接種于25 cm×25 cm培養(yǎng)瓶中，接種密度5×105個(gè)/mL，每瓶5 mL，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：①對照組，培養(yǎng)液中不加任何干預(yù)；②尼古丁組，培養(yǎng)液中加入100 μmol/L尼古?。虎跾TS 組，培養(yǎng)液中加入100 nmol/L STS；④尼古丁+STS組，培養(yǎng)液中先加入100 nmol/L STS預(yù)處理細(xì)胞30 min，再加入100 μmol/L尼古丁。細(xì)胞孵育12 h后收集各組的細(xì)胞及上清液。每組均設(shè)4個(gè)復(fù)瓶，重復(fù)3次。

1.3 PAI-1蛋白測定 采用ELISA法檢測各組HUVECs上清液中PAI-1蛋白含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為120 μg/L、60 μg/L、30 μg/L、15 μg/L、7.5 μg/L、3.75 μg/L及1.875 μg/L。

1.4 PAI-1 mRNA測定 采用RT-PCR法檢測各組HUVECs中PAI-1 mRNA表達(dá)水平。按Trizol試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取5 μL cDNA進(jìn)行PCR的擴(kuò)增反應(yīng)。PAI-1引物序列：正向引物5′-TGCCCTCTACTTCAACGG-3′，反向引物5′-GTCGGTCATTCCCAGGTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段390 bp。GAPDH引物序列：正向引物5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，反向引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為307 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共32個(gè)循環(huán)。采用相對Ct值法檢測PAI-1 mRNA，結(jié)果以Ct值表示，相對于β-actin或GAPDH的比值為2-ΔΔCt。其中，Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.5 HUVECs的PKC-α定位變化 采用免疫熒光染色法檢測各組HUVECs的PKC-α定位變化。具體操作步驟(均避光進(jìn)行)：將蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板中，生長良好的HUVECs重懸于完全培養(yǎng)基中，接種密度2×104個(gè)/mL，待細(xì)胞長滿蓋玻片后去除上清液，按STS干預(yù)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組并干預(yù)，孵育12 h后收集蓋玻片，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗2次，以4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，制成細(xì)胞爬片。取固定好的細(xì)胞爬片，PBS洗滌2次，重懸于PBS(1∶100)及PKC-α一抗(1∶300)中，在37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次后，將細(xì)胞重懸于含熒光FITC-羊抗小鼠IgG二抗(1∶30)的緩沖劑中，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次后，進(jìn)行4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，PBS洗滌2次，熒光顯微鏡下觀察各組HUVECs的PKC-α定位變化。

1.6 胞膜與胞漿PKC-α表達(dá)水平測定 采用蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測各組HUVECs胞膜與胞漿PKC-α表達(dá)水平。取分組處理的凍存細(xì)胞，按10 μL/mg的比例加入預(yù)冷的胞漿蛋白裂解液，充分溶解細(xì)胞。4 ℃、3 000 r/min離心30 min，取其上清液為胞漿蛋白成分。沉淀物再加相同體積的膜相關(guān)蛋白裂解液，同上述離心條件處理后，取其上清液為膜相關(guān)蛋白成分。電泳分離胞漿及胞膜蛋白后轉(zhuǎn)膜，PKC-α一抗(1∶1 000)及β-actin一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，清洗一抗后HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，增加化學(xué)發(fā)光法顯色后，將所得結(jié)果經(jīng)高分辨多功能分析圖文分析系統(tǒng)采集，進(jìn)行灰度分析，各組PKC-α條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示PKC-α的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組HUVECs PAI-1蛋白及mRNA表達(dá)水平比較 尼古丁組PAI-1蛋白及mRNA表達(dá)水平均較對照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；尼古丁+STS組PAI-1蛋白及mRNA表達(dá)水平較尼古丁組下降，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。詳見表1。

表1 各組HUVECs中PAI-1蛋白、mRNA表達(dá)水平比較 (±s)

2.2 尼古丁對HUVECs中PKC-α定位的影響 對照組HUVECs中PKC-α的綠色熒光均勻分布于細(xì)胞漿中；尼古丁孵育后胞內(nèi)PKC-α發(fā)生移位，在細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯的綠色熒光；STS處理組胞漿的綠色熒光減弱；尼古丁+STS組細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度低于尼古丁組。詳見圖1。

圖1 尼古丁對HUVECs中PKC-α定位的影響

2.3 各組HUVECs胞膜與胞漿PKC-α蛋白表達(dá)水平比較 蛋白免疫印跡法顯示各組均有一條80 kDa 的蛋白帶。尼古丁組胞膜PKC-α蛋白增高，胞漿PKC-α蛋白降低，胞膜/胞漿PKC-α蛋白表達(dá)增高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。尼古丁+STS 組胞膜PKC-α蛋白較尼古丁組降低，胞漿PKC-α蛋白較尼古丁組升高，胞膜/胞漿PKC-α蛋白較尼古丁組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。詳見圖2、圖3及表2。

圖2 各組HUVECs胞膜PKC-α蛋白的表達(dá)

表2 各組HUVECs胞膜與胞漿PKC-α蛋白表達(dá)比較 (±s)

2.4 胞膜PKC-α蛋白與PAI-1 mRNA、蛋白表達(dá)的關(guān)系 胞膜PKC-α蛋白表達(dá)與PAI-1 mRNA及蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r值分別為0.813、0.882，P均<0.05)；胞漿PKC-α蛋白與PAI-1 mRNA及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.744、-0.797，P均<0.05)。詳見圖4。

圖4 胞膜、胞漿PKC-α蛋白與PAI-1 mRNA、蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

吸煙與多種血栓性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，尸檢和臨床研究表明，吸煙對受損的內(nèi)皮細(xì)胞有直接毒性作用，可導(dǎo)致凝血功能改變和血小板反應(yīng)性增加，這與動脈粥樣硬化形成的致病性有關(guān)[4-5]，吸煙也是靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。目前，吸煙引起靜脈血栓形成的具體機(jī)制尚不清楚，因此，探討香煙煙霧的主要有害物質(zhì)尼古丁對靜脈內(nèi)皮細(xì)胞纖溶平衡的影響及其機(jī)制具有重要意義。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血小板聚集以及維持凝血和纖維蛋白溶解的平衡方面起著核心作用，PAI-1釋放失調(diào)會破壞凝血和纖溶平衡，導(dǎo)致血栓形成[7]。本課題組前期在吸煙與內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1表達(dá)方面已有一系列研究，杜艷等[2]的體外實(shí)驗(yàn)表明，尼古丁可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1蛋白和mRNA的表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的纖溶活性。PKC是一類磷脂依賴性蛋白激酶，其包括3大類12個(gè)亞型，PKC-α屬PKC亞型中的鈣離子依賴型或經(jīng)典型，通常存在于多種細(xì)胞的胞漿中，在內(nèi)皮細(xì)胞增殖凋亡調(diào)控、炎性因子黏附及內(nèi)皮通透性改變等方面發(fā)揮作用[8]。有研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外因素的刺激后，可導(dǎo)致其胞內(nèi)PKC-α表達(dá)增加并伴隨其轉(zhuǎn)位。因此，PKC的轉(zhuǎn)位被認(rèn)為是其活化的標(biāo)志[9]。在尼古丁介導(dǎo)HUVECs表達(dá)PAI-1時(shí)PKC-α的表達(dá)變化及其活性轉(zhuǎn)位特征研究尚少。

朱朝霞等[10]研究發(fā)現(xiàn)PKC-α主要分布于血管內(nèi)膜和外膜，且隨著暴露時(shí)間的延長，PKC-α表達(dá)逐漸增加，提示PKC-α在煙霧暴露肺血管重構(gòu)中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察了在尼古丁上調(diào)HUVECs表達(dá)PAI-1的過程中PKC-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中的作用，結(jié)果顯示尼古丁組PKC-α胞膜蛋白表達(dá)較對照組明顯增高，STS阻斷后尼古丁組胞膜蛋白降低，提示尼古丁可致HUVECs胞膜PKC-α蛋白的表達(dá)發(fā)生變化。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PKC-α胞膜蛋白與PAI-1呈正相關(guān)，PKC-α胞漿蛋白與PAI-1呈負(fù)相關(guān)，提示PKC-α活化參與了尼古丁誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能紊亂，與國內(nèi)一些研究結(jié)果[3，11-12]相似。文獻(xiàn)報(bào)道，PKC活化方式依類型細(xì)胞、刺激物及其亞型而不同，有的由胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜、細(xì)胞骨架處，有的則轉(zhuǎn)移至核周或核內(nèi)[9，13-16]。免疫熒光染色可見，尼古丁干預(yù)后HUVECs PKC-α胞漿熒光減弱，而在胞膜出現(xiàn)明顯的綠色熒光，尼古丁聯(lián)合STS干預(yù)后上述改變被部分抑制，表明尼古丁處理后HUVECs胞漿中的PKC-α活化，其方式是由胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，提示尼古丁促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1表達(dá)增強(qiáng)部分是通過PKC-α信號通路的激活而實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)而推斷減少煙霧吸入或使用PKC-α抑制劑可能有益于保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的纖溶功能，防止血栓性疾病的發(fā)生。

總之，在尼古丁上調(diào)HUVECs表達(dá)PAI過程中，伴隨內(nèi)皮細(xì)胞胞膜、胞漿PKC-α蛋白的表達(dá)變化及PKC-α的膜轉(zhuǎn)位，并且胞膜PKC-α蛋白與PAI-1表達(dá)呈正相關(guān)，PKC-α活化移位可能是尼古丁介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞纖溶紊亂的關(guān)鍵步驟之一。