王路瑤，杜廷海，靳新悅，李俊楠，張露苗

急性心肌梗死是一種嚴(yán)重的心血管疾病，最終會導(dǎo)致心肌的缺血性壞死，目前最有效的治療措施是及時進行心肌血流灌注，以顯著減少心肌梗死面積，改善臨床預(yù)后。但有時缺血后再灌注不僅不能使組織器官功能恢復(fù)，反而會出現(xiàn)心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)的變化和血管無復(fù)流等現(xiàn)象，加重功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。迄今為止，MIRI仍是臨床上難以解決的問題。中醫(yī)學(xué)中活血化瘀類中藥對心血管疾病療效顯著，研究活血化瘀類中藥對MIRI的相關(guān)機制及作用靶點為治療此類疾病開辟了新的思路。三七為五加科植物三七 Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根，味甘、微苦，性溫，歸肝、胃經(jīng)，具有化瘀止血、活血定痛之效，可用于人體內(nèi)各種出血，尤以有瘀滯者為宜；現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)三七具有抗血小板聚集、溶栓、抗心律失常等作用[2]。紅花為菊科植物紅花 Carthamus tinctorius L.的籬狀花冠，味辛，性溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛之效，可用于胸痹心痛、血瘀腹痛、癥瘕積聚等證；現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)紅花具有增加冠狀動脈流量、改善心肌缺血、縮小心肌梗死范圍、抗心律失常等作用[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，在疾病-基因-靶點-藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上通過網(wǎng)絡(luò)分析，系統(tǒng)綜合地揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的機制，進而指導(dǎo)藥物研發(fā)及藥理作用研究。分子對接技術(shù)是通過化學(xué)計量學(xué)方法模擬分子的幾何匹配和能量匹配，來尋找小分子(配體)與生物大分子(受體)之間最佳結(jié)合模式的過程，分子對接在中藥活性成分的虛擬篩選和確定作用靶標(biāo)等方面已展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[3]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從系統(tǒng)、整體水平探究三七-紅花藥對抗MIRI“多因、多效、多靶點”的作用機制，并通過分子對接技術(shù)對藥物活性成分和疾病核心靶點進行分子對接，以期為深入開展三七-紅花藥對抗MIRI的基礎(chǔ)實驗研究及臨床合理應(yīng)用提供研究思路。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)是一個融合了藥物化學(xué)、藥代動力學(xué)、藥物-靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)的藥理學(xué)平臺，包含了499味草藥以及29 384種化合物成分、3 311種作用靶點和837種相關(guān)疾病[4]。Uniprot數(shù)據(jù)庫是國際上序列數(shù)據(jù)最完整、注釋信息最豐富的非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到三七和紅花的所有化合物成分，通過頁面的過濾器圖標(biāo)自定義篩選結(jié)果，選擇化合物分子的篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，篩選出活性成分較高的化合物，利用TCMSP平臺得到有效成分的靶點蛋白，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將預(yù)測出的靶點蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 MIRI相關(guān)靶點獲取 人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.Genecards.org/)是一個全面提供所有有關(guān)人類基因注釋和預(yù)測信息的基因數(shù)據(jù)庫，在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/)是涵蓋關(guān)于人類遺傳病和基因等信息的數(shù)據(jù)庫。通過檢索GeneCard數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫收集與MIRI相關(guān)的所有靶點，數(shù)據(jù)庫以關(guān)鍵詞“myocardial ischemia reperfusion injury”進行搜索，收集整合與MIRI相關(guān)的靶點基因。

1.3 藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析 為明確“三七-紅花”與MIRI潛在靶點間的相互作用，利用Venn在線軟件將藥物與疾病靶點取交集，通過Venn圖的形式展現(xiàn)藥物靶點與疾病靶點間的潛在靶點基因，運用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 靶點蛋白交互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于String數(shù)據(jù)庫獲取高置信度的交集PPI信息，運用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Network Analyzer工具進行拓?fù)鋵W(xué)分析。根據(jù)介度(betweenness centrality，BC)、緊密度(closeness centrality，CC)及連接度(Degree)的中位數(shù)來篩選化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點。

1.5 成分-靶點分子對接驗證 分別從三七和紅花的有效成分中選取度值排名前5位成分(1個成分重復(fù))與度值排名前10位的核心靶點進行分子對接，從RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock軟件進行加氫、加電子等操作。從ChemicalBook數(shù)據(jù)庫(https://www.chemicalbook.com/)中下載化合物結(jié)構(gòu)，并使用AutoDock軟件進行加氫、加電子、加ROOT等操作，得到結(jié)果中每個蛋白結(jié)合能最低的兩組，使用Pymol軟件對得到的最佳結(jié)果進行繪圖。

1.6 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 以人類為研究對象，利用Bioconductor R軟件包對不同模塊的靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析，分析不同模塊靶點基因的生物學(xué)意義，從而分析藥物治療疾病的可能機制。

2 結(jié) 果

2.1 “三七-紅花”的有效成分及作用靶點 TCMSP數(shù)據(jù)庫中共篩選出30個候選化合物，其中三七8個、紅花22個，去除重復(fù)項，共得到27個候選化合物，詳見表1。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得有效成分的相應(yīng)靶點蛋白，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫將預(yù)測出的靶點蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名，去除重復(fù)項并刪除非人源靶點后，最終得到三七-紅花藥對有效成分相應(yīng)靶點基因203個。

表1 三七-紅花的有效活性成分

2.2 MIRI靶點的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫得到MIRI相關(guān)靶點1 223個，通過篩選設(shè)置relevance score≥6，最終獲得472個相關(guān)靶點。從OMIM數(shù)據(jù)庫得到與MIRI相關(guān)靶點52個，篩重后共獲得疾病相關(guān)靶點511個。

2.3 化合物-靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析 利用Venny在線分析軟件將“三七-紅花”的活性化合物對應(yīng)的203個藥物靶點與MIRI的511個疾病靶點取交集，通過Venn圖(見圖1)的形式得到81個共同靶點。將81個共同靶點通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建三七和紅花“化合物-靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。由圖2可見，節(jié)點分別表示三七-紅花的活性成分與疾病作用靶標(biāo)，而圖中多個靶標(biāo)可對應(yīng)相同的活性成分，一個靶標(biāo)也可與不同的活性成分相對應(yīng)，說明三七-紅花藥對抗MIRI具有多成分、多靶標(biāo)的特點。

圖1 三七-紅花有效成分靶點和MIRI相關(guān)靶點關(guān)系的Venn圖

圖2 化合物-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點的篩選 利用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建的高置信度交集靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)見圖3，網(wǎng)絡(luò)共有81個節(jié)點和1 425條邊。拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)Degree中位數(shù)為35，BC中位數(shù)為0.002 888 82，CC中位數(shù)為0.640 000 00，滿足上述參數(shù)卡值的靶點分別為趨化因子CC基元配體(CCL2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、基質(zhì)金屬肽酶9(MMP9)等39個靶點可作為治療作用的核心靶點，在治療作用中可能發(fā)揮了重要作用。詳見表2。

圖3 三七-紅花藥對抗MIRI相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 三七-紅花藥對抗MIRI相關(guān)靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果

2.5 分子對接結(jié)果 篩選的度值排名前10位的核心靶點與9個關(guān)鍵藥效成分對接結(jié)果見圖4，表3中詳細(xì)列出9個關(guān)鍵藥效成分的基本信息。其中，胡蘿卜素(beta-carotene)因分子量太大，無法與大分子蛋白對接。其中橫坐標(biāo)為靶蛋白，縱坐標(biāo)為化合物，顏色的深淺代表最低結(jié)合能的大小。所有分子與標(biāo)靶蛋白的最低結(jié)合能都小于0，說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，最低結(jié)合能越小說明分子與靶點蛋白結(jié)合越好。對接結(jié)果顯示，IL-6、AKT1、MMP9、CCL2最低結(jié)合能小于-5.0 kJ/mol，說明以上9個核心活性成分與以上靶點蛋白結(jié)合較好。對三七-紅花與上述核心靶點蛋白對接結(jié)果進行可視化，三七-紅花9個關(guān)鍵藥效成分中baicalein和靶點IL-6、木犀草素(luteolin)和靶點MMP9、甘草素(Liquiritigenin)與靶點CCL2分別形成氫鍵的數(shù)目為3個、5個、2個，而豆甾醇(Stigmasterol)和靶點AKT1之間沒有氫鍵相互作用。詳見圖5。

圖4 靶點-活性成分最低結(jié)合熱圖

表3 三七-紅花9個核心成分基本信息

圖5 4個核心蛋白分子與9個核心成分對接結(jié)果可視化

2.6 三七-紅花藥對抗MIRI的GO功能和KEGG通路富集分析

2.6.1 GO功能富集分析 利用Bioconductor R軟件包對81個靶點進行GO富集分析，以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得出1 284個生物學(xué)過程(biological process，BP)，主要包括對氧含量的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)控、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、凝血、止血等；32個細(xì)胞組成(cellular component，CC)，包括局灶性粘連、細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、線粒體外膜等；67個分子功能(molecular function，MF)，包括細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、支架蛋白結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性與細(xì)胞凋亡的關(guān)系、受體配體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、內(nèi)肽酶活性等，各類別前20位的通路見圖6，表明三七-紅花藥對可以通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮抗MIRI作用。

2.6.2 KEGG通路富集分析 利用Bioconductor R軟件包對81個靶點進行KEGG通路富集分析，以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共富集125條通路，排名前20位的通路見圖7。主要富集的通路為流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號途徑、細(xì)胞凋亡、C型凝集素受體信號通路、Toll樣受體信號通路、Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號通路，并與胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌等癌癥通路有相關(guān)性。將篩選出來的前20個KEGG信號通路和靶點基因?qū)隒ytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“靶點-通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖8。以上研究結(jié)果表明，三七-紅花藥對的活性成分靶點分布于不同的路徑，可通過各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗MIRI作用。

圖7 三七-紅花作用靶點KEGG富集分析的前20條通路

圖8 關(guān)鍵靶基因KEGG通路富集分析

3 討 論

中醫(yī)學(xué)沒有MIRI的相關(guān)描述，根據(jù)其病位和臨床表現(xiàn)可以歸屬于“胸痹”“心悸”“真心痛”等范疇。MIRI的中醫(yī)病機屬于各種病因所致的心脈痹阻，常虛實夾雜[5]，但以氣虛為本，貫穿整個MIRI的病理過程，血瘀、痰飲為標(biāo)，其中血瘀為重，痰飲為輕[6]，故治療上應(yīng)以補虛為主，兼以活血化瘀、豁痰宣痹，其中活血化瘀治法有重要作用，三七-紅花為此治法的有效藥對之一。三七功善化瘀止血、活血定痛之效；紅花功善活血通經(jīng)、祛瘀止痛；二藥相合，共增活血化瘀之功效?，F(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)三七-紅花有效組分復(fù)方通過抗炎和抗凋亡發(fā)揮對心肌梗死大鼠的保護作用[7]，可提高對人肝微粒體中UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的3種主要同工型的抑制能力[8]。但是對于三七-紅花藥對抗MIRI的所有潛在靶標(biāo)、相關(guān)機制及分子層面的研究仍有欠缺。本研究基于多成分、多靶點作用的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)和分子對接技術(shù)，分析和驗證三七-紅花藥對抗MIRI的作用機制。

本研究共收集“三七-紅花”主要活性成分27個，包括皂苷類、木脂素、黃芩素、黃芩苷、槲皮素、山奈酚、木犀草素等。相關(guān)研究表明人參皂苷Rh2可改善高脂大鼠氧化應(yīng)激與炎癥水平，增加大鼠心肌缺血再灌注后外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，從而保護受損心肌[9]；槲皮素可降低MIRI大鼠的乳酸脫氫酶水平、心室期前收縮、心動過速、心室顫動的數(shù)量和持續(xù)時間以及心律不齊的嚴(yán)重程度，說明槲皮素在MIRI過程中具有抗心律失常作用[10]。實驗研究發(fā)現(xiàn)木脂素可能通過抑制中性粒細(xì)胞浸潤或影響血脂代謝而對高脂血癥大鼠MIRI有一定的保護作用[11]。黃芩素具有很強的抗氧化作用，黃芩素聯(lián)合棕櫚酰乙醇酰胺治療可減少心肌組織損傷、中性粒細(xì)胞浸潤、肥大細(xì)胞活化表達的標(biāo)志物(糜酶和類胰蛋白酶)和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)]，降低應(yīng)激氧化并調(diào)節(jié)核因子-κB(NF-κB)和細(xì)胞凋亡途徑[12]。黃芩苷通過促進PI3K釋放一氧化氮來保護MIRI大鼠的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞[13]。山奈酚通過降低晚期糖基化產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)/MAPK誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減輕糖尿病大鼠的MIRI[14]。木犀草素可通過內(nèi)皮一氧化氮合酶相關(guān)的抗氧化反應(yīng)減輕糖尿病心臟的缺血/再灌注損傷[15]。本研究基于String交互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建三七-紅花藥對抗MIRI靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出39個核心靶點，分析發(fā)現(xiàn)IL-6、白蛋白(ALB)、AKT1、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、MAPK8、MMP9、半胱氨酸蛋白酶3基因(CASP3)等是網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵核心靶點，可能在三七-紅花藥對抗MIRI中發(fā)揮重要作用。結(jié)合分子對接結(jié)果，發(fā)現(xiàn)9個關(guān)鍵藥效成分與IL-6、AKT1、MMP9、CCL2對接結(jié)合能都小于-5.0 kJ/mol，說明9個關(guān)鍵藥效成分與以上靶點蛋白結(jié)合較好，推測三七-紅花藥對有效成分可能通過這些靶點發(fā)揮作用。IL-6是重要的炎性因子，心肌缺血再灌注時IL-6及其受體表達明顯增加，并且IL-6具有雙重作用，既能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、心肌細(xì)胞表達黏附因子CD11b/CD18和細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)而損傷心肌，又能通過Janus激酶激活信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子STAT1和STAT3，激活細(xì)胞信號過程，抑制再灌注心肌細(xì)胞凋亡，減少梗死面積[16]。AKT1是在心肌組織中高表達的1個亞型，研究表明AKT1介導(dǎo)的糖原合成酶激酶-3(GSK-3)活性抑制對于MIRI后的心臟保護至關(guān)重要[17]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)是一組依賴于鋅離子且以降解細(xì)胞外基質(zhì)成分作為底物的蛋白水解酶，研究發(fā)現(xiàn)MMPs快速參與缺血再灌注損傷等氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時發(fā)現(xiàn)其抑制劑能有效抑制MIRI的發(fā)生。MMP9是MMPs家族中的主要成員，研究發(fā)現(xiàn)血清中MMP9濃度的增加與冠狀動脈事件發(fā)生的危險程度呈正相關(guān)[18]。CC趨化因子受體2(CCR2)缺乏可減輕小鼠MIRI引起的氧化應(yīng)激，縮小梗死面積[19]。在三七-紅花藥對抗MIRI的GO分析中，得出1 284個生物學(xué)過程，其中對氧含量的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)控、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程等生物過程大部分都與MIRI相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，三七-紅花藥對抗MIRI主要涉及IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、JAK2/STAT3信號通路等。在MIRI過程中，白細(xì)胞介素-23(IL-23)、IL-17炎性因子表達明顯增高，而且阻斷IL-23、IL-17都能明顯減輕MIRI，說明IL-17信號通路與MIRI的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[20]。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進增殖的關(guān)鍵作用，近年來，研究發(fā)現(xiàn)該信號通路與多種心血管疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸有著密切的關(guān)系。多項實驗證明中藥復(fù)方可通過激活PI3K/Akt途徑保護心肌細(xì)胞免受缺血/再灌注損傷[21-22]。研究表明Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的先天免疫和炎癥反應(yīng)在加重心肌缺血的損傷中起關(guān)鍵作用，其通過激活下游NF-κB、PI3K等信號通路，促進炎性因子釋放，從而介導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷[23]。JAK2/STAT3信號通路是炎癥反應(yīng)中的經(jīng)典通路，可通過對下游眾多靶點發(fā)揮調(diào)控作用，如GSK-3、NF-κB、雷帕霉素靶蛋白、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及TNF-α等。多項實驗證明中藥成分及中藥復(fù)方可通過調(diào)控JAK-STAT3信號通路保護MIRI[24-26]。因此，推測三七-紅花藥對活性成分可能通過作用于這些信號通路中的關(guān)鍵因子達到抗MIRI的目的。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究了三七-紅花藥對抗MIRI的主要作用靶點，構(gòu)建了三七-紅花藥對抗MIRI的靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)，運用分子對接方法對關(guān)鍵靶點進行驗證，通過對三七-紅花活性成分抗MIRI作用靶點的生物過程及通路富集，闡述了三七-紅花藥對通過多靶點、多通路作用發(fā)揮抗MIRI的作用，為進一步深入探討其臨床作用機制提供了先導(dǎo)信息和基礎(chǔ)。