林少清，舒 磊，杜興冉，馮旰珠*

1南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2感染科，江蘇 南京 210011

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種非發(fā)酵性、專性需氧的革蘭陰性桿菌，在自然界廣泛存在，可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等機體多個系統(tǒng)感染。PA 可通過鞭毛、菌毛、脂多糖及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等破壞呼吸道上皮細(xì)胞，在呼吸道定植和感染［1］。研究發(fā)現(xiàn)，下呼吸道感染患者支氣管肺泡灌洗液分離培養(yǎng)的病原菌中，PA 居于第2 位［2］。現(xiàn)如今，隨著多重耐藥（multi-drug resistant，MDR）及泛耐藥（extensively drug resistant，XDR）菌株的出現(xiàn)，防治PA 引起的感染成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題［3］。當(dāng)PA 及其分泌的毒性分子作用于機體時，主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及NK 細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞進(jìn)行防御，研究表明，巨噬細(xì)胞在抵抗PA 肺部感染過程中具有重要作用［4］。

吞噬是巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌的首要環(huán)節(jié)，肺泡巨噬細(xì)胞吞噬受阻是下呼吸道感染加重的重要原因之一［5-6］。PA 可通過鞭毛、分泌蛋白及其群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）等多種方式影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能，從而在較大程度上影響感染的進(jìn)程［7-9］。研究發(fā)現(xiàn)，PA的重要毒性因子綠膿菌素在體內(nèi)外均能抑制巨噬細(xì)胞對機體凋亡細(xì)胞的吞噬［8］；Zhang 等［10］研究表明，敲除PA的毒性因子調(diào)節(jié)蛋白AnvM后，則能促進(jìn)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S對PA的吞噬效應(yīng)；與上述不同的是，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PA 群體感性系統(tǒng)的rhlI表達(dá)則有利于巨噬細(xì)胞對PA的吞噬［11］。這些結(jié)果表明，PA的結(jié)構(gòu)物或分泌物可以不同方式影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能。因此，研究PA對肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響對探究PA感染機制有重要意義。

我們前期在對PA 部分分泌蛋白的抗原性篩選時發(fā)現(xiàn)，Pec1 有一定的抗原性。Pec1 是PA 感染狀態(tài)下分泌的一種蛋白，由275個氨基酸構(gòu)成，并且研究發(fā)現(xiàn)，Pec1 是一種潛在的毒性因子［12］，但其在PA致病過程中的具體功能及作用機制尚未見報道。為此，本研究擬觀察重組PA分泌蛋白Pec1對MH-S細(xì)胞吞噬功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

PA野生株（PAO1）為南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗中心保存菌；大腸埃希菌（E.coli）DH5α、大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3）、pMD19-T 以及pET-30a（+）（Novagen公司，美國）；小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株MH-S 細(xì)胞（上海中喬新舟公司）；DNA 連接酶、DNA 聚合酶和限制性內(nèi)切酶NdeⅠ與HindⅢ（Invitrogen 公司，美國）；PCR 擴增試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒及鎳柱（南京金斯瑞公司）；CCK-8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒、中性紅染液、吖啶橙AO染色試劑盒以及碘化丙啶PI染色試劑盒（南京凱基生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI 的PAO1 菌株信息設(shè)計Pec1 序列特異引物，上游引物：5′-ATGAGTGTCCGCTTTCGCCCCCTGGAT-3′；下游引物：5′-TCAGCGAATTCCACCGTCGC-3′，引物及反應(yīng)模板均由南京金斯瑞公司設(shè)計并合成。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性1 min、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察條帶。試劑盒純化擴增產(chǎn)物，NdeⅠ與HindⅢ雙酶切純化的PCR 產(chǎn)物，并插入pMD19-T 質(zhì)粒，16 ℃過夜。用氯化鈣法將pMD19-T-pec1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有IPTG和X-gal的抗氨芐青霉素LB 平板上37 ℃孵育過夜，挑選陽性菌落進(jìn)行酶切鑒定。將酶切正確的重組質(zhì)粒pMD19-Tpec1 經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ酶切后，插入至表達(dá)載體pET-30a（+），轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含抗氨芐青霉素LB 平板上37 ℃孵育過夜，選擇陽性克隆進(jìn)行測序和酶切鑒定。

1.2.2 重組蛋白Pec1的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將攜帶pET-30a-pec1 重組表達(dá)載體的單克隆E.coliBL21（DE3）接種于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min 培養(yǎng)過夜。再轉(zhuǎn)接至含卡那霉素（100 μg/mL）的TB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)4 h，再加入IPTG，15 ℃下誘導(dǎo)16 h。收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞后的上清過鎳親和層析柱，經(jīng)洗脫液洗脫后，收集純化洗脫液。SDS-PAGE 電泳分析條帶，BSA測定蛋白濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，將蛋白分裝凍存于-80 ℃。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖水平

將MH-S細(xì)胞以1×104個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜后，分別加入濃度為0、10、20、40、80、160 μg/mL的重組蛋白Pec1 進(jìn)行刺激，每個濃度設(shè)5 個平行復(fù)孔。培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育24、48、72 h 后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長讀取吸光度值。

1.2.4 吞噬中性紅實驗

于12 孔板中接種MH-S 巨噬細(xì)胞2×105個/孔，培養(yǎng)過夜后，分別加入濃度為0、40、80、120 μg/mL的重組蛋白Pec1 刺激24 h。PBS 洗滌3 遍后，加入0.01%中性紅溶液200 μL/孔，吞噬30 min后，用PBS洗3 遍，加入裂解液作用30 min，使用Bio-Rad 酶標(biāo)儀于562 nm波長處讀取吸光度值。吞噬指數(shù)=各濃度實驗孔吸光度值/對照孔吸光度值。

1.2.5 熒光顯微鏡觀察吞入胞內(nèi)的滅活PAO1

以2×105個/孔接種MH-S 細(xì)胞于12 孔板，培養(yǎng)過夜后，分別加入濃度為0、40、80、120 μg/mL 的重組蛋白Pec1 刺激24 h。銅綠假單胞菌PAO1 在LB培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后，90 ℃水浴滅活1 h，PBS洗滌3次，用PI標(biāo)記滅活的PAO1，離心洗滌3次后，PBS懸浮滅活菌沉淀，以MOI 100∶1比例加入滅活的細(xì)菌懸液500 μL/孔，細(xì)胞吞噬15 min后，PBS漂洗3次，AO染色細(xì)胞15 min，用熒光顯微鏡隨機選取5個視野拍照，采用Image J軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，每個實驗單獨重復(fù)3 次，兩組間比較用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA），并進(jìn)行線性趨勢檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pec1基因的擴增與質(zhì)粒構(gòu)建

經(jīng)PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，顯示的條帶與預(yù)期一致，大小約828 bp（圖1A）。純化后的PCR片段經(jīng)NdeⅠ、HindⅢ酶切后與pMD19-T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，可看到大小約3 520 bp的重組pMD19-T-pec1質(zhì)粒條帶、2 692 bp的pMD19-T質(zhì)粒條帶和828 bp的基因Pec1條帶，與理論值相符（圖1B）。重組pET-30a-pec1 表達(dá)載體是重組pMD19-T-pec1 質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、HindⅢ酶切后插入至pET-30a質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞所得，圖中可見5 422 bp的pET-30a質(zhì)粒條帶和828 bp的基因Pec1 條帶（圖1C），與預(yù)期相符，且測序結(jié)果與NCBI 的數(shù)據(jù)庫比對一致，提示重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白Pec1的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液裂解、鎳親和層析柱分離純化后的上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示明顯目的條帶，大小約30.5 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。

2.3 Pec1對MH-S細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8法檢測重組蛋白Pec1對MH-S細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，分別用不同濃度的Pec1刺激細(xì)胞后，在24、48、72 h 3個時間點觀察，隨著刺激濃度的增加，重組蛋白Pec1對MH-S細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 Pec1對MH-S細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of the recombinant protein Pec1 on MH-S cell proliferation

2.4 Pec1對MH-S細(xì)胞吞噬中性紅功能的影響

不同濃度的Pec1 刺激MH-S 細(xì)胞24 h 后，檢測細(xì)胞吞噬中性紅的能力。結(jié)果表明，0（對照組）、40、80、120 μg/mL Pec1 處理的吞噬指數(shù)分別為1.00±0.04、0.82±0.02、0.04±0.01、0.03±0.01，表明隨著Pec1 濃度的增大，MH-S 細(xì)胞吞噬中性紅能力逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖4）

圖4 Pec1對MH-S細(xì)胞吞噬中性紅的影響Figure 4 Effect of the recombinant protein Pec1 on phagocytosis of neutral red by MH-S cells

2.5 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察經(jīng)PI 標(biāo)記的滅活PAO1（圖5A），與對照組相比，40、80、120 μg/mL 的Pec1 蛋白刺激MH-S 細(xì)胞后，加入滅活PAO1 吞噬30 min，隨著刺激濃度的增高，吞入胞內(nèi)的滅活菌逐漸減少，且胞內(nèi)相對熒光定量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5B，P＜0.001）。

圖5 Pec1對MH-S細(xì)胞吞噬滅活銅綠假單胞菌PAO1的影響Figure 5 Effect of the recombinant protein Pec1 on phagocytosis of heat-inactivated Pseudomonas aeruginosa PAO1 by MH-S cells

3 討論

單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是機體發(fā)揮吞噬作用的主要固有免疫細(xì)胞，當(dāng)入侵的病原體被吞入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞通過釋放胞內(nèi)活性分子（活性氧）、過氧化氫酶、抗菌肽等殺傷病原微生［13］，此外，中性粒細(xì)胞還可通過胞外陷阱殺傷病原體［14］。Thanabalasuriar 等［15］在體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，敲除PA 分泌的胞外多糖psl（ΔpslA）能促進(jìn)中性粒細(xì)胞對敲除株的識別與吞噬，且體外實驗也能證實這種現(xiàn)象，表明psl有助于PA 逃避中性粒細(xì)胞識別，機制可能與其抑制補體在PA 表面激活與沉積有關(guān)；另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，被巨噬細(xì)胞吞入的PA 能依賴于銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）分泌的ExoS促進(jìn)PA從巨噬細(xì)胞囊泡中逃脫，從而利于PA的免疫逃逸［16］；Yu等［17］研究表明，T3SS 的蛋白PcrV，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞株RAW264.7 對PA 的吞噬，同時，可促進(jìn)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）向促炎型M1型分化，增加iNOS、ROS、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，從而有利于巨噬細(xì)胞對PA 生物膜的清除。由此可見，PA可以分泌多種不同毒性因子，而不同毒力因子對宿主免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)影響不同，本研究主要探討了PA 分泌蛋白Pec1 對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。

本研究成功構(gòu)建了PA 重組蛋白Pec1，以不同濃度的Pec1 蛋白刺激MH-S 細(xì)胞24、48、72 h 后發(fā)現(xiàn)，Pec1 濃度越高，MH-S 細(xì)胞的增殖能力越弱，其中，以120 μg/mL 作用72 h 的抑制作用最強。同時觀察發(fā)現(xiàn)，Pec1 濃度越高，巨噬細(xì)胞對中性紅和PA的吞噬能力越低。這些結(jié)果表明，PA 蛋白Pec1 能對MH-S細(xì)胞的吞噬作用產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

近年來，有不少學(xué)者將吞噬與自噬相聯(lián)系，自噬可通過異體自噬和LC3相關(guān)吞噬作用（LC3-associated phagocytosis，LAP）參與病原微生物的清除［18-19］。Pehote等［20］發(fā)現(xiàn)，RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)香煙煙霧暴露處理后，敲除調(diào)控自噬溶酶體基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）的處理組，與對照組相比，巨噬細(xì)胞對PA吞噬減少，同時也抑制了其對PA的清除。研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白Lyn是聯(lián)系吞噬與自噬的關(guān)鍵分子。PA 感染MH-S 后，經(jīng)TLR4/TLR2 識別入胞，一方面，通過磷酸化Lyn，將包裹PA 的吞噬體經(jīng)Rab 家族蛋白（如Rab5、Rab7）運輸至溶酶體；另一方面，磷酸化的Lyn啟動異體自噬，形成包裹PA的自噬體運至溶酶體，最終包裹PA的雙層膜囊泡與溶酶體融合并在其內(nèi)降解［21］。而Wu 等［22］發(fā)現(xiàn)，β-防御素2 和β-防御素3通過下調(diào)早期生長反應(yīng)基因-1（the early growth response gene-1，Egr-1）和原癌基因c-FOS 抑制巨噬細(xì)胞自噬，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對酵母多糖的吞噬作用，促進(jìn)PA 的清除。上述研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞可通過促進(jìn)或抑制自噬，繼而影響吞噬功能，最終影響胞內(nèi)PA的清除。

本研究初步觀察到PA分泌的Pec1蛋白能夠抑制MH-S巨噬細(xì)胞對滅活PA的吞噬，該分泌蛋白影響吞噬的具體機制，是否對巨噬細(xì)胞自噬產(chǎn)生影響尚待進(jìn)一步深入研究。