劉 萍，周 宏，伍雪橙，黃張建，孔 輝，解衛(wèi)平*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 南京 210029；2中國藥科大學新藥研究中心天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一類由多種病因引起的，以肺動脈壓力異常升高，同時合并不同程度右心功能衰竭為特征的肺血管疾病［1］。PH 在大于65 歲人群中的患病率高達10%，其中低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是最為常見的PH類型之一，常見于慢性缺氧（chronic hypoxia，CH）性肺病患者［2］。目前HPH的治療以原發(fā)病的治療為主，尚無推薦的靶向藥物［3］，無法逆轉慢性缺氧導致的肺血管重構和肺血管阻力進行性升高，HPH患者預后仍然較差，因此探索治療HPH的潛在靶點勢在必行。

研究表明，針對多靶點聯(lián)合用藥已成為治療PH的重要方向。ROCK 信號通路是目前研究PH 發(fā)病機制的熱點之一。ROCK選擇性抑制劑法舒地爾是一種細胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，可阻斷肌球蛋白輕鏈磷酸化，抑制血管收縮、痙攣，被用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣、冠狀動脈疾病等［4］，在不同PH實驗動物模型中均有降低肺動脈壓力、抑制肺動脈重塑的功能［5-6］，近期一項臨床研究表明，法舒地爾在重度PH患者中也具有良好的治療效果［7］。此外，丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）信號通路也是PH研究的關注重點。PDK抑制劑二氯乙酸鹽（dichloroacetate，DCA）可活化細胞表面Kv1.5 通道，減少鈣離子內(nèi)流，抑制細胞收縮、增殖，同時可抑制PDK 恢復丙酮酸脫氫酶活性，改善線粒體能量代謝，維持細胞正常生理功能［8］，臨床上主要用于治療乳酸性酸中毒和代謝性疾病，也可用于抑制野百合堿誘導的大鼠肺血管重構［9］，目前已進入臨床研究階段［10］?；诜ㄊ娴貭柡虳CA在PH動物模型及患者中的治療作用，我們發(fā)現(xiàn)法舒地爾鹽酸鹽解離出的游離胺基可以和二氯乙酸結合形成一種新型水溶性口服鹽類化合物——法舒地爾二氯乙酸鹽（fasudil dichloroacetate，F(xiàn)DCA）［11］。本研究主要目的在于探討FDCA 對慢性缺氧誘導的PH大鼠的治療作用并揭示其潛在機制，為HPH治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級成年健康雄性SD大鼠24只，體重（230±20）g，由南京醫(yī)科大學動物中心提供。本研究所有實驗操作經(jīng)由南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理審查委員會許可（IACUC-2005021）。

FDCA（中國藥科大學天然藥物國家重點實驗室制備），實驗動物缺氧箱（杭州艾普儀器設備有限公司），RIPA 裂解液、BCA 檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），大鼠白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）ELISA試劑盒、肌球蛋白輕鏈磷酸化酶（myosin light chain phosphorylase，MLCP）ELISA 試劑盒（南京翼飛雪生物科技有限公司），β-actin、ROCK1、ROCK2抗體（Proteintech公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 HPH動物模型的建立及給藥方案

SD大鼠隨機分為4組：對照組（CON組）、CON+FDCA組、CH組、CH+FDCA組，每組6只。將CH組及CH+FDCA組大鼠置于常壓低氧箱中，艙內(nèi)氧氣濃度維持在（10.0±0.1）%，同時放置鈉石灰吸收CO2，變色硅膠吸收水蒸氣。每天開箱1 h 更換飲用水、飼料、墊料、鈉石灰與變色硅膠，其余時間均保持低氧環(huán)境。CON 組與CON+FDCA 組置于正常環(huán)境中。缺氧第15 天開始，CON+FDCA 組及CH+FDCA 組予FDCA（43.3 mg/kg）灌胃治療，CON 及CH 組予等體積生理鹽水，每天1次，于開箱1 h內(nèi)完成，持續(xù)14 d?？側毖鯐r間為28 d。

1.2.2 右心導管檢查及右心室肥厚程度測定

所有大鼠稱重后予以2%戊巴比妥鈉溶液（60mg/kg）腹腔注射麻醉。將麻醉后大鼠仰臥固定于動物操作臺上，分離右頸總靜脈并做一“V”型切口，插入充盈肝素鈉溶液的聚乙烯導管。導管彎頭端經(jīng)上腔靜脈、右心房至右心室，另一端連接壓力換能器，應用Powerlab 生物信號采集系統(tǒng)測定右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）。RVSP 測定結束后處死大鼠，收集大鼠心臟。沿室間隔邊緣游離出右心室（right ventricle，RV）及左心室+室間隔（left ventricle+septum，LV+S）。濾紙吸干水分后分別稱量RV 和LV+S 的重量，計算RV/（LV+S）比值，即為右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）。

1.2.3 肺小動脈形態(tài)學分析

寶玉爹說，這本來是岳舞臺老生泰斗丁愛田老先生的絕活，一次偶然的機會，我找他的徒弟偷學了一點，也只不過學了一點皮毛而已。

分離左肺上葉，在4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后制成5 μm 厚度切片并進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、α-SMA 免疫組織化學染色及Masson染色，于光學顯微鏡下觀察肺小動脈病理變化。每張切片隨機拍攝至少20 張直徑30～100 μm 肺小動脈，計算肺小動脈中膜層肥厚程度（pulmonary artery medial thickness，PAMT）=（血管外徑-血管內(nèi)徑）/血管外徑×100%。根據(jù)肺小動脈α-SMA陽性表達部分占血管周徑的比例，將肺小動脈分為非肌化（＜25%）、部分肌化（25%～75%）和完全肌化（＞75%）3種類型，分別統(tǒng)計各類型血管所占百分比。使用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計Masson染色圖片中藍色區(qū)域膠原蛋白沉積面積與總面積的比值，評估肺小動脈外膜纖維化程度。

1.2.4 右心室形態(tài)學分析

分離右心室組織，在4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后制成5 μm 厚度切片并進行HE 染色。在光學顯微鏡下觀察右心室心肌細胞病理變化。使用Image J 軟件統(tǒng)計右心室心肌細胞橫截面積（cross-sectional area，CSA）。

1.2.5 ELISA法檢測肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α以及MLCK、MLCP水平

稱取100 mg 肺組織，剪碎加入1 mL PBS，勻漿后3次凍融使細胞破壞釋放出細胞內(nèi)成分，4 ℃離心機，3 000 r/min 離心20 min，收集上清。按照ELISA試劑盒說明書進行分析。肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量最終以pg/mL計算，MLCK、MLCP水平最終以U/L計算。

1.2.6 Western blot 檢測肺組織中ROCK1、ROCK2表達水平

稱取30 mg 大鼠肺組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，剪碎、勻漿，提取肺組織總蛋白。BCA 法測定蛋白含量。蛋白經(jīng)電泳分離后轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入抗ROCK1、ROCK2抗體（稀釋比例1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入二抗（稀釋比例1∶5 000），室溫孵育1 h。TBST 洗滌3 次后加入ECL 化學發(fā)光液，置于化學發(fā)光儀中合適條件下曝光并保存圖像，結果用Image Lab軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。多組樣本間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，組間比較使用LSD-t檢驗法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FDCA對HPH大鼠RVSP和RVHI的影響

圖1 FDCA對HPH大鼠RVSP和RVHI的影響Figure 1 Effects of FDCA on RVSP and RVHI in rats with HPH

2.2 FDCA對HPH大鼠右心室心肌細胞肥大的影響

HE 染色結果顯示：CON 組與CON+FDCA 組右心室心肌細胞結構正常，CSA 較?。籆H 組右心室心肌細胞肥大；CH+FDCA 組心肌細胞較CH 組變?。▓D2A）。右心室CSA 統(tǒng)計結果顯示：與CON 組及CON+FDCA 組相比，CH 組右心室心肌細胞CSA 顯著增加；CH+FDCA 組右心室心肌細胞CSA較CH組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖2B）。

圖2 FDCA對HPH鼠右心室心肌細胞肥大的影響Figure 2 Effects of FDCA on right ventricular cardiomyocyte hypertrophy in rats with HPH

2.3 FDCA 對HPH 大鼠肺小動脈中膜肥厚及炎癥浸潤的影響

HE 染色結果顯示：CON 組與CON+FDCA 組肺小動脈結構正常，血管壁薄，血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤；CH組肺小動脈中膜層增厚，血管周圍有大量炎癥細胞浸潤；CH+FDCA組肺小動脈中膜層較CH 組變薄，炎癥細胞浸潤程度較CH 組減輕（圖3A）。PAMT統(tǒng)計結果顯示：與CON組及CON+FDCA組相比，CH組PAMT顯著增加；CH+FDCA組PAMT較CH組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3B）。

圖3 FDCA對HPH大鼠肺小動脈中膜肥厚的影響Figure 3 Effects of FDCA on pulmonary arterial medial thickness in rats with HPH

2.4 FDCA對HPH大鼠肺小動脈肌化程度的影響

α-SMA免疫組織化學染色結果顯示：CON組及CON+FDCA 組肺小動脈壁α-SMA 陽性區(qū)域較少；CH組肺小動脈壁α-SMA陽性區(qū)域增加；FDCA治療可以減少血管周圍α-SMA 陽性沉積（圖4A）。肌化血管類型統(tǒng)計結果顯示：CON組及CON+FDCA組肺小動脈以非肌化血管為主，CH組完全肌化血管比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與CH組相比，CH+FDCA可以顯著減少完全肌化血管比例，肌化程度以非肌化和部分肌化為主（P＜0.01，圖4B）。

圖4 FDCA對HPH大鼠肺小動脈肌化程度的影響Figure 4 Effects of FDCA on muscularization of pulmonary artery in rats with HPH

2.5 FDCA對HPH大鼠肺小動脈外膜纖維化的影響

Masson染色結果顯示：CON組與CON+FDCA組肺小動脈外膜層僅有少量藍色膠原沉積，CH 組肺小動脈外膜層藍色膠原沉積區(qū)域增加，CH+FDCA組藍染區(qū)域較CH組減輕（圖5A）。肺小動脈外膜纖維化程度統(tǒng)計結果顯示：與CON組及CON+FDCA組相比，CH 組肺小動脈外膜纖維化程度顯著增加；CH+FDCA 組肺小動脈外膜纖維化程度較CH 組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖5B）。

圖5 FDCA對HPH大鼠肺小動脈外膜纖維化的影響Figure 5 Effects of FDCA on fibrosis of pulmonary arteriolar adventitia in rats with HPH

2.6 FDCA 對HPH 大鼠肺組織中炎癥因子水平的影響

ELISA法檢測肺組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。統(tǒng)計結果顯示：CON 組及CON+FDCA 組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均無明顯差異（P＞0.05，圖6）。與CON 組相比，CH 組肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均明顯增加；CH+FDCA 組肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α的表達較CH組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖6）。CH+FDCA組TNF-α的表達水平與CON組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖6C）。

圖6 FDCA對HPH大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達的影響Figure 6 Effects of FDCA on expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in pulmonary tissues of rats with HPH

2.7 FDCA對HPH大鼠肺組織中MLCK和MLCP表達水平的影響

ELISA 法檢測肺組織勻漿中MLCK 和MLCP 的水平。統(tǒng)計結果顯示：CON 組及CON+FDCA 組MLCK、MLCP的表達水平均無明顯差異（P＞0.05）。與CON 組相比，CH 組肺組織勻漿中MLCK表達水平明顯增加，MLCP 表達水平明顯降低；CH+FDCA 組與CH 組相比，肺組織中MLCK 表達水平降低，MLCP 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖7）。CH+FDCA 組肺組織MLCK、MLCP 的表達水平與CON 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖7 FDCA對HPH大鼠MLCK、MLCP表達的影響Figure 7 Effects of FDCA on expression of MLCK and MLCP in rats with HPH

2.8 FDCA 對HPH 大鼠肺組織中ROCK1、ROCK2蛋白表達的影響

Western blot 半定量結果顯示：CON 組及CON+FDCA 組ROCK1、ROCK2的表達水平均無明顯差異（P＞0.05）。與CON 組相比，CH 組肺組織勻漿中ROCK1、ROCK2 表達水平均明顯增加；CH+FDCA組與CH 組相比，肺組織中ROCK1、ROCK2 表達水平均有所降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖8）；與CON 組相比，CH+FDCA 組肺組織ROCK1、ROCK2 的表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖8 FDCA對HPH大鼠ROCK1、ROCK2表達的影響Figure 8 Effects of FDCA on expression of ROCK1 and ROCK2 in rats with HPH

3 討論

HPH 是臨床上常見的一類PH，常繼發(fā)于慢性阻塞性肺疾病、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、間質性肺病、慢性高原病等慢性缺氧性疾?。?2］。HPH 的發(fā)生發(fā)展過程與肺血管結構、功能異常密切相關。慢性缺氧可以引起炎癥反應、肺血管收縮、肺動脈重構（包括肺血管床內(nèi)膜損傷、中膜肥厚與外膜纖維化），導致遠端肺小血管閉塞，肺動脈管腔逐漸狹窄，肺血管阻力進行性升高，進而出現(xiàn)右心功能衰竭甚至死亡［13-15］。本研究采用慢性缺氧誘導的大鼠PH模型，探討FDCA對HPH的治療作用。結果顯示缺氧4 周大鼠RVSP 異常升高，右心室代償性肥厚，伴隨明顯的肺血管壁肥厚、肌化以及纖維化，提示成功構建HPH大鼠模型。FDCA可緩解慢性缺氧誘導的大鼠肺血管重構，調(diào)節(jié)血流動力學參數(shù)，減輕右心室肥厚，提示FDCA對HPH具有良好的治療作用。

缺氧誘導的肺血管重構是HPH 重要的發(fā)病機制。肺血管重構是遺傳因素、表觀遺傳因素以及環(huán)境因素共同作用的結果。近年來，炎癥反應在肺血管重構中的作用備受關注［16］。研究發(fā)現(xiàn)PH動物模型及PH患者肺組織中均可見大量炎癥細胞在重構的肺血管周圍積累并向血管內(nèi)浸潤。這些肺血管細胞和炎癥細胞可在局部產(chǎn)生大量細胞因子和趨化因子，主要包括IL-1β、IL-6、TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1和趨化因子-5等。這些促炎細胞因子和趨化因子表達增加，可進一步促進血管細胞過度收縮與增殖，導致肺血管重塑［17］。研究表明，促炎性細胞因子水平升高的PH 患者臨床預后較差，其中IL-6、IL-8、IL-10 等細胞因子的表達水平與PH 患者生存惡化相關［18-19］。本研究結果顯示，F(xiàn)DCA可顯著抑制HPH 模型大鼠肺組織中重構血管周圍的炎癥細胞浸潤及肺組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，提示FDCA可減輕缺氧誘導的肺組織慢性炎癥反應，這可能是其減輕肺小血管重構的重要原因之一。

肺血管重構機制復雜，涉及多個信號通路，其中ROCK通路是研究的熱門通路之一。ROCK蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是小GTP酶Rho A下游的效應分子，有ROCK1和ROCK2兩個同工型，在人體內(nèi)參與調(diào)控細胞形態(tài)、增殖、黏附和運動等重要的生物過程，在心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝疾病及癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［20-21］。ROCK1 和ROCK2 結構相似，具有高度的序列同源性，可以共享相同的蛋白質靶標。這兩種亞型的ROCK分布廣泛，ROCK1 主要在肺組織、肝、腎、脾和炎癥細胞中大量表達，ROCK2主要分布在心臟、血管、肌肉（包括平滑?。?2］。ROCK蛋白在HPH患者及動物模型肺組織中表達上調(diào)，參與炎癥反應、肺血管收縮、肺血管重構等多個病理生理過程，但ROCK1和ROCK2的作用尚不完全明確。研究表明，在缺氧條件下，ROCK2通過誘導氧化應激、促進炎性細胞因子分泌調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的增殖和遷移，促進肺血管重構［23-24］。在新生血管內(nèi)膜形成過程中，ROCK1參與炎癥細胞的募集、炎癥因子的釋放、血管細胞的增殖、內(nèi)皮黏附分子的表達以及血管平滑肌細胞遷移［20］。在心臟組織中，研究證明使用ROCK抑制劑可抑制小鼠病理性心肌肥大與心臟重塑［25］。本研究HPH模型大鼠肺組織中ROCK1和ROCK2的表達上調(diào)，F(xiàn)DCA可抑制慢性缺氧誘導的ROCK1和ROCK2的表達，提示FDCA可能部分通過抑制ROCK通路抑制炎癥反應、減輕肺血管重構和右心室肥厚。

缺氧誘導的肺血管舒縮功能失調(diào)是HPH 肺血管阻力持續(xù)性升高的重要病理生理機制。MLCK和MLCP通過調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈磷酸化水平來調(diào)節(jié)細胞收縮的一組關鍵酶。MLCK 是一種鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶，可使肌球蛋白輕鏈磷酸化，觸發(fā)肺血管收縮；而MLCP 負責使磷酸化的肌球蛋白輕鏈脫磷酸，維持血管舒張，兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài)。研究表明，缺氧可抑制離子通道Kv1.5，升高肺動脈平滑肌細胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度，上調(diào)MLCK 表達，誘導細胞收縮，即鈣依賴的細胞收縮。DCA 可抑制PDK 活性使Kv1.5 表達增加，減少肺動脈平滑肌細胞鈣離子內(nèi)流，從而抑制MLCK活性，改善肺血管收縮［26］。另一方面，缺氧激活ROCK通路，通過磷酸化MLCP的肌球蛋白結合亞基使MLCP失活，促進細胞收縮，即非鈣依賴的細胞收縮。法舒地爾可抑制ROCK恢復MLCP活性，使細胞恢復舒張狀態(tài)。在缺氧誘導的雙重收縮機制下，肺動脈持續(xù)收縮，肺血管阻力進行性升高［27-28］。本研究中，F(xiàn)DCA治療逆轉了HPH模型大鼠肺組織中MLCK表達的增加和MLCP表達的降低，提示FDCA可同時作用于鈣離子依賴的收縮機制和非鈣依賴的收縮機制，抑制肺血管收縮，這可能是FDCA治療HPH的另一重要機制。

綜上所述，F(xiàn)DCA 可同時靶向ROCK 通路和PDK通路，通過多個機制共同抑制慢性缺氧誘導的肺血管收縮與重構，降低肺動脈壓力，緩解右心室肥大，在HPH 動物模型上的治療效果顯著。且FDCA的兩個基礎藥物法舒地爾與DCA 已在臨床廣泛使用，其安全性已被證實。然而，F(xiàn)DCA 作為一個分子，其相對于法舒地爾和DCA 的組合，在整體的組織分布和生物利用度方面有哪些優(yōu)勢，仍需要進一步研究來揭示潛在的機制。此外，DCA抑制PDK活性、恢復細胞能量代謝后對ROCK 通路是否有所影響，也需要深入的細胞分子生物學研究來闡明?？傊?，本研究結果表明，F(xiàn)DCA有望成為未來治療HPH的候選藥物之一。