彭麗瑤，魏桂紅，黃張建，孔 輝，解衛(wèi)平*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，江蘇 南京 210029；2中國藥科大學(xué)新藥研究中心天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一類以肺血管重構(gòu)及肺血管阻力進(jìn)行性升高為特征，右心室后負(fù)荷逐漸增加，最終導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡的進(jìn)展性疾病。肺血管重構(gòu)是PAH發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為肺血管內(nèi)膜增生、中膜肥厚、外膜纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤等［1］。研究表明，肺動脈外膜是最早響應(yīng)血管應(yīng)激或損傷并發(fā)生病理改變的結(jié)構(gòu)［2］。在缺氧、血管擴(kuò)張等各種因素的作用下，肺動脈外膜成纖維細(xì)胞（pulmonary artery adventitia fibroblast，PAAF）作為肺動脈外膜中主要的細(xì)胞成分首先被激活，主要表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖、遷移能力顯著增強(qiáng)，并可以向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生更多的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、生長因子、趨化因子以及炎性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞的生長，參與肺血管重構(gòu)過程［3］。

缺氧可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），當(dāng)ROS 的產(chǎn)生超過了機(jī)體抗氧化防御能力時，組織細(xì)胞便會出現(xiàn)基因突變、凋亡壞死、脂質(zhì)過氧化等一系列氧化應(yīng)激損傷。研究表明，氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)肺血管過度收縮、肺動脈內(nèi)皮功能障礙以及肺血管重構(gòu)，參與PAH的發(fā)生發(fā)展［4］。核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子-2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在維持細(xì)胞的氧化還原平衡及代謝中發(fā)揮重要作用［5］。甲基巴多索?。╞ardoxolone methyl，CDDO-Me）是一種新型三萜類齊墩果酸衍生物，可激活Keap1/Nrf2/ARE 信號通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，在慢性腎?。?］、2型糖尿?。?］、急性肺損傷及肺纖維化［8-9］中具有潛在治療作用。然而目前尚無研究報道其對缺氧誘導(dǎo)的PAAF的影響。本文旨在探索CDDO-Me 對缺氧誘導(dǎo)的PAAF 活化后功能的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人PAAF、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基（ScienCell 公司，美國），CDDO-Me（中國藥科大學(xué)黃張建教授惠贈），CCK-8 試劑盒（同仁公司，日本），轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β ELISA 檢測試劑盒（武漢華美生物），2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA，Sigma公司，美國），總谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（上海碧云天生物），總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。βactin 抗體、α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、Ⅰ膠原蛋白（Collagen Ⅰ）抗體、羊抗兔/羊抗鼠二抗（武漢Proteintech 公司），波形蛋白（Vimentin）抗體（Abcam 公司，美國），NF-κB pp65/p65 抗體、p-Smad3/Smad3 抗體（CST 公司，美國），羊抗兔熒光二抗（Invitrogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人PAAF 培養(yǎng)于成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基中（含2%胎牛血清、1%成纖維細(xì)胞生長因子、100 U/mL青霉素及鏈霉素），置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至70%融合時分組處理，分為4組：常氧組、缺氧組、缺氧+CDDO-Me 組、常氧+CDDO-Me組，其中缺氧組和缺氧+CDDO-Me組置于含5%CO2、1%O2缺氧箱中處理。CDDO-Me在放入缺氧箱前1 h加入。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

收集對數(shù)生長期的人PAAF，按每孔1×104個細(xì)胞接種于96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)基，按照分組分別加入無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度CDDO-Me工作液。1 h后，將缺氧組及缺氧+CDDO-Me組置入缺氧箱中培養(yǎng)。24 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK-8原液的培養(yǎng)基100 μL，孵育4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測吸光度。細(xì)胞活性=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.2.3 Transwell遷移實驗

收集對數(shù)生長期的人PAAF，PBS洗滌3遍后用無血清培養(yǎng)基將其重懸制成1×105個/mL 的細(xì)胞懸液，在Transwell 上室中加入100 μL 細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL 含所需藥物的完全培養(yǎng)基。根據(jù)分組，置于不同培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后取出小室，棄去上室培養(yǎng)基，用棉簽擦去小室膜上層細(xì)胞，多聚甲醛固定，PBS 洗滌，結(jié)晶紫染色后于顯微鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 圖像分析軟件分析每組遷移至下室的細(xì)胞所占面積，計算細(xì)胞相對遷移率。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光分析

人PAAF以5×104個/孔的密度接種于24孔板細(xì)胞爬片上，隔天棄去培養(yǎng)基，藥物處理1 h后分別置于不同培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS清洗后多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100 PBS液洗滌20 min，5%BSA室溫封閉1 h，隨后加入一抗α-SMA、p65（1∶200），置于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次后加入免疫熒光二抗（1∶1 000），置于室溫孵育1 h。PBS清洗后每孔加入Hoechst 33342染核30 min，PBS清洗后用抗熒光淬滅液封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 Western blot

收集處理后的人PAAF，PBS洗3遍后加入預(yù)冷的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳、濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，隨后加入一抗（1∶1 000）置于4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 洗膜后加入二抗（1∶8 000），室溫孵育1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影，使用Image Lab圖像分析軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.2.6 氧化應(yīng)激水平檢測

ROS 檢測：按照1.2.4 方法培養(yǎng)細(xì)胞，24 h 后棄去培養(yǎng)基，每孔加入無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA（10 μmol/L），37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

GSH、MDA 和SOD 檢測：按照1.2.5 方法收集細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說明書操作，GSH 檢測在412 nm 波長處測定吸光度、MDA 檢測在532 nm 波長處測定吸光度、SOD檢測在450 nm波長處測定吸光度。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

人PAAF 以5×104個/孔的密度接種于24 孔板中，隔天棄去培養(yǎng)基，藥物處理1 h后分別置入不同培養(yǎng)箱培養(yǎng)，藥物處理24 h后收集細(xì)胞上清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取出?xì)胞上清和ELISA檢測試劑盒室溫復(fù)溫30 min，按照試劑盒說明書操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測各孔吸光度值。應(yīng)用CurveExpert 軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本吸光度值計算細(xì)胞因子濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示，多組間樣本統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDDO-Me 對缺氧誘導(dǎo)的PAAF 細(xì)胞活力和遷移的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，在常氧條件下，500.0 nmol/L及以下濃度的CDDO-Me 對細(xì)胞活力的影響與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1A），表明500.0 nmol/L 及以下濃度的CDDO-Me 對PAAF 無細(xì)胞毒性。缺氧刺激24 h 可以顯著增強(qiáng)PAAF 細(xì)胞活力，與常氧組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）；CDDO-Me 可以濃度依賴性地降低缺氧誘導(dǎo)的PAAF 細(xì)胞活力的升高，并在250.0 nmol/L 和500.0 nmol/L 濃度時具有顯著抑制作用（P＜0.05），故使用500.0 nmol/L 的CDDO-Me 進(jìn)行后續(xù)研究。Transwell 遷移實驗結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著增加，而缺氧+CDDO-Me 組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少（P＜0.05，圖1C、D），提示CDDO-Me 可以顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的PAAF 遷移。上述結(jié)果表明，缺氧可以誘導(dǎo)PAAF 細(xì)胞活力和遷移能力增強(qiáng)，而CDDO-Me可以顯著抑制上述改變。

圖1 CDDO-Me對缺氧誘導(dǎo)的PAAF細(xì)胞活力和遷移的影響Figure 1 Effects of CDDO-Me on the viability and migration of PAAF induced by hypoxia

2.2 CDDO-Me 對缺氧誘導(dǎo)的PAAF 向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示（圖2A），在常氧條件下PAAF呈現(xiàn)細(xì)長紡錘狀，細(xì)胞整體長度較長，寬度較窄。在缺氧刺激24 h后，PAAF的胞體寬度增加，細(xì)胞呈現(xiàn)肥大改變，而缺氧+CDDO-Me 組的PAAF 細(xì)胞肥大程度得到改善。同時，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示（圖2B），與常氧組相比，缺氧組PAAF內(nèi)α-SMA熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而缺氧+CDDO-Me 組α-SMA 熒光強(qiáng)度相較于缺氧組顯著減弱。Western blot 半定量結(jié)果進(jìn)一步表明，缺氧可以顯著上調(diào)PAAF 中肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物Collagen Ⅰ、Vimentin 和α-SMA 的表達(dá)水平，與常氧組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2C～E）。而缺氧+CDDO-Me 組PAAF 的Collagen Ⅰ、Vimentin和α-SMA的表達(dá)水平與缺氧組相比顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導(dǎo)的PAAF向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

圖2 CDDO-Me對缺氧誘導(dǎo)的PAAF向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Figure 2 Effects of CDDO-Me on the myofibroblast transformation of PAAF induced by hypoxia

2.3 CDDO-Me對缺氧誘導(dǎo)的PAAF氧化應(yīng)激的影響

ROS 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧組PAAF 中ROS 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.05，圖3A、B），提示缺氧顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，而CDDOMe可顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的ROS升高，與缺氧組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，缺氧刺激24 h后，PAAF 中反映細(xì)胞氧化損傷程度的重要指標(biāo)MDA 的表達(dá)水平顯著上調(diào)，發(fā)揮細(xì)胞抗氧化作用的GSH和SOD表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05，圖3C～E）。與缺氧組相比，CDDO-Me可以顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)生，并上調(diào)GSH和SOD表達(dá)水平（P＜0.05）。

圖3 CDDO-Me對缺氧誘導(dǎo)的PAAF氧化應(yīng)激的影響Figure 3 Effects of CDDO-Me on the oxidative stress of PAAF induced by hypoxia

2.4 CDDO-Me 對缺氧誘導(dǎo)的PAAF 中TGF-β1/Smad3信號通路的影響

ELISA（圖4A）及Western blot 結(jié)果（圖4B）顯示，與對照組相比，缺氧組PAAF合成分泌的細(xì)胞因子TGF-β1水平顯著升高，Smad3磷酸化水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。與缺氧組相比，缺氧+CDDO-Me 組PAAF 的TGF-β1 表達(dá)水平以及Smad3 磷酸化水平顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導(dǎo)的PAAF 中TGF-β1/Smad3 信號通路的激活。

圖4 CDDO-Me對缺氧誘導(dǎo)的PAAF中TGF-β1/Smad3信號通路的影響Figure 4 Effects of CDDO-Me on the TGF-β1/Smad3 signaling pathway in PAAF induced by hypoxia

2.5 CDDO-Me 對缺氧誘導(dǎo)的PAAF 中NF-κB 信號通路的影響

免疫熒光結(jié)果顯示（圖5A），常氧組PAAF中NFκB（p65）主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，缺氧組NF-κB 主要表達(dá)于細(xì)胞核中，表明缺氧可誘導(dǎo)NF-κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，而CDDO-Me 處理后可抑制上述改變。Western blot和ELISA結(jié)果進(jìn)一步表明，與對照組相比，缺氧組PAAF 中NF-κB 磷酸化蛋白水平顯著上調(diào)，同時NF-κB 信號通路下游靶基因IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，圖5B～D）。與缺氧組相比，CDDO-Me處理可以顯著降低NF-κB磷酸化水平，并下調(diào)IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，CDDO-Me可以抑制缺氧誘導(dǎo)的PAAF中NF-κB信號通路的激活。

圖5 CDDO-Me對缺氧誘導(dǎo)的PAAF中NF-κB信號通路的影響Figure 5 Effects of CDDO-Me on the NF-κB signaling pathway in PAAF induced by hypoxia

3 討論

肺血管重構(gòu)是PAH特征性的病理改變，涉及肺血管內(nèi)膜和中膜增厚以及血管外膜的纖維化。肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和平滑肌細(xì)胞過度增殖是PAH的研究重點，而成纖維細(xì)胞作為血管外膜最豐富的細(xì)胞成分，其在PAH發(fā)生發(fā)展中的作用常被忽略。近年來越來越多的研究表明，在響應(yīng)損傷和應(yīng)激時，血管外膜成纖維細(xì)胞最先被激活，在肺循環(huán)和體循環(huán)血管結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［2，10］。尤其是在缺氧條件下，肺血管外膜常在肺動脈中膜增厚以及肺血管壓力升高之前便出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變，包括成纖維細(xì)胞的過度增殖與遷移、肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、大量膠原蛋白的沉積以及ECM的重構(gòu)［11］。這種改變不僅使血管壁順應(yīng)性降低，同時ECM作為多種大分子蛋白組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其成分變化參與調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞增殖、遷移、分化等多種生物學(xué)過程［12］。

氧化應(yīng)激損傷在缺氧性PAH 中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。缺氧刺激血管壁細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，同時細(xì)胞內(nèi)清除ROS的能力下降，細(xì)胞自身的氧化/抗氧化平衡失調(diào)造成大量ROS蓄積，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥、凋亡、壞死，促進(jìn)血管重構(gòu)［13］。ROS還可以與一氧化氮（nitric oxide，NO）相互作用降低NO的生物利用度，增加血管張力［14］。Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游如GSH、硫氧還蛋白、醌氧化還原酶等抗氧化相關(guān)蛋白及細(xì)胞保護(hù)酶的表達(dá)，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。CDDO-Me 是一種半合成的齊墩果酸衍生物，可以有效激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路，誘導(dǎo)抗氧化相關(guān)蛋白及酶類的表達(dá)，降低ROS水平，保護(hù)細(xì)胞功能［15］。研究顯示，CDDO-Me 可以減輕缺血再灌注引起的大鼠急性腎損傷［16］、保護(hù)糖尿病腎病腎小管功能［17］，也可以減輕放射線照射和博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷和纖維化［8-9］。此外近年來研究表明，CDDO-Me 可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制平滑肌細(xì)胞收縮［18］。Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示CDDO-Me可改善PAH患者運動耐力［19］。以上研究均提示CDDO-Me 具有較大的PAH治療潛力。本課題組前期研究結(jié)果表明，CDDO-Me可降低野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠平均肺動脈壓，在PAH 動物模型中具有一定治療作用［20］。然而目前CDDO-Me對PAAF生物學(xué)功能的影響尚不明確。

肺血管外膜纖維化是肺血管重構(gòu)的一個重要病理改變。在缺氧性PAH早期，肺動脈外膜便出現(xiàn)大量表達(dá)α-SMA 的肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞作為膠原蛋白和其他ECM蛋白的主要產(chǎn)生細(xì)胞，在誘導(dǎo)血管外膜纖維化、降低血管順應(yīng)性中發(fā)揮重要作用［21］。此外，肌成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的收縮和遷移能力，參與血管新生內(nèi)膜的形成［22］。本研究結(jié)果顯示，CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導(dǎo)的PAAF過度增殖、遷移和肥大，抑制α-SMA、Vimentin和Collagen Ⅰ的表達(dá)，提示CDDO-Me 能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的PAAF向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程受到復(fù)雜的微環(huán)境調(diào)控，包括生長因子、細(xì)胞因子、黏附分子和ECM 分子。研究表明，缺氧可以誘導(dǎo)NADPH氧化酶（NADPH oxidases，Nox）表達(dá)增加，進(jìn)而產(chǎn)生大量ROS，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化［23］。抑制Nox4 或應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平可以改善博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化［24］。本研究結(jié)果表明，CDDO-Me可以顯著升高細(xì)胞中GSH水平，增加抗氧化金屬酶SOD的表達(dá)，減少缺氧誘導(dǎo)的ROS 蓄積和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的生成，提示CDDO-Me 可以提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。此外，缺氧還可以通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)來促進(jìn)TGF-β1 的分泌，促進(jìn)纖維化進(jìn)程［25］。TGF-β1是強(qiáng)有力的促纖維化細(xì)胞因子，其下游底物分子Smad3 可以結(jié)合促纖維化相關(guān)蛋白的啟動子區(qū)域，促進(jìn)α-SMA和膠原蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子的產(chǎn)生并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，從而減少ECM降解，因此TGF-β1/Smad3信號通路的過度活化是纖維化疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一［26］。本研究結(jié)果證實，缺氧可以促進(jìn)PAAF分泌細(xì)胞因子TGF-β1，激活下游Smad3 信號通路，而CDDO-Me能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的TGF-β1/Smad3信號通路的活化。以上實驗結(jié)果表明，CDDO-Me可能通過減少PAAF 中ROS 的蓄積，抑制缺氧誘導(dǎo)的TGF-β1/Smad3 信號通路的活化來調(diào)控PAAF 向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

此外，成纖維細(xì)胞可以分泌多種炎性因子［27］，研究表明，其可能通過激活STAT3、C/EBPβ等信號通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的招募與激活，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向炎癥表型轉(zhuǎn)化，參與PAH 的發(fā)生發(fā)展［28］。NF-κB活化是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，靜息狀態(tài)下NF-κB與IκB 結(jié)合存在于胞漿中，其功能受到抑制。當(dāng)細(xì)胞外信號刺激時，IκB被泛素化降解，NF-κB得以解離并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)炎癥趨化因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1和多種炎癥細(xì)胞因子（如IL-6和TNF-α）的表達(dá)，在炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖與凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［29］。本研究結(jié)果顯示，缺氧可以激活PAAF中NF-κB信號通路，誘導(dǎo)NF-κB的核轉(zhuǎn)位，升高NF-κB 蛋白磷酸化水平并促進(jìn)炎癥因子IL-1β和TNF-α的合成釋放。而CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導(dǎo)的PAAF 中NF-κB 信號通路的活化，降低下游炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)。這一結(jié)果與既往研究相一致，即Nrf2信號通路與NF-κB信號通路之間具有相互作用，Nrf2信號通路的激活可以抑制NFκB的活化以及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)［30］，同時CDDOMe也在多種疾病模型中表現(xiàn)出抗炎作用［15］。

綜上所述，CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導(dǎo)的PAAF增殖、遷移以及肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其可能與提高PAAF 抗氧化應(yīng)激能力、降低ROS 水平并抑制TGF-β1/Smad3信號通路相關(guān)。CDDO-Me 還可以抑制缺氧誘導(dǎo)的NF-κB 信號通路活化，減少PAAF 炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用?，F(xiàn)有的PAH治療藥物在改善肺血管重構(gòu)方面作用有限，以CDDO-Me為載體研發(fā)的CDDO-NO，兼具擴(kuò)張肺血管和抑制肺血管重構(gòu)的作用，在野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠模型中具有一定治療效果［20］。在今后的研究中，仍需進(jìn)一步探索CDDO-Me 及以其為載體的生物合成藥物更深層次的分子作用機(jī)制以及信號通路，為PAH的治療提供新的方向。