余軍軍，藍(lán)棋浩，寧 軍，韋 田，梁立杰，孫 堅(jiān)

（1.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東新興 527400；2.廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東新興 527400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）是由土霉素在6-位脫氧而制成的第二代半四環(huán)素衍生物，又名強(qiáng)力霉素或脫氧土霉素，由美國(guó)輝瑞制藥廠在上世紀(jì)60年代發(fā)明[1]。多西環(huán)素是廣譜抗生素，對(duì)腸球菌、肺炎球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、衣原體、支原體和立克次氏體等具有良好的抗菌效果[2]。因其在體內(nèi)具有分布廣、長(zhǎng)效、高生物利用度和無(wú)明顯腎毒性等特點(diǎn)，臨床上廣泛應(yīng)用于豬、牛、雞和羊的養(yǎng)殖，以治療呼吸道、消化道和泌尿道的細(xì)菌性疾病。隨著多西環(huán)素在獸醫(yī)臨床上的使用，其殘留問(wèn)題也越來(lái)越被重視。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)多西環(huán)素在動(dòng)物體內(nèi)的殘留消除的研究已有很多，但對(duì)多西環(huán)素在體內(nèi)的殘留監(jiān)控主要用動(dòng)物的可食用組織，尿液和血液中多西環(huán)素殘留的消除及殘留監(jiān)控較少[3-4]。本文通過(guò)計(jì)算多西環(huán)素在豬體內(nèi)的休藥期，并預(yù)測(cè)休藥期豬尿液和血液中藥物殘留量范圍，以探索尿液或血液樣品用于多西環(huán)素殘留監(jiān)控的可操作性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀（QTRAP 5500，美國(guó)AB SCIEX公司）；組織勻漿機(jī)（HM6300，北京Lab Precition公司）；氮吹儀（MV5，北京萊伯泰科公司）；電子分析天平（BT125D，德國(guó)Sartorius公司）；冷凍高速離心機(jī)（5804R，德國(guó)Eppendorf公司）；C18固相吸附劑（月旭科技公司）；6cc/200 mg的固相萃取小柱（Oasis HLB，美國(guó)Waters公司）。

1.1.2 試劑

多西環(huán)素對(duì)照品，純度97.2%，批號(hào)1-F-4F4-1，美國(guó)CATO公司；多西環(huán)素-D3對(duì)照品，純度97%，批號(hào)T291402，加拿大TRC公司；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，購(gòu)于德國(guó)默克公司；正己烷、三氯乙酸為分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸多西環(huán)素可溶性粉，獸藥字190172193，含量10%，批號(hào)20191004，購(gòu)于河北遠(yuǎn)征禾木藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)與管理

選擇健康、體重相近的三元雜商品豬41頭（40.5±3.8） kg，隨機(jī)分成2組，分別為對(duì)照組1頭，試驗(yàn)組40頭。試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飲水中添加鹽酸多西環(huán)素可溶性粉，制成多西環(huán)素濃度為50 mg/L的藥液，連續(xù)混飲給藥5 d。于停藥后第1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、12 d、15 d和18 d隨機(jī)選擇5頭豬只，采集組織（肌肉、肝臟、腎臟、肺臟）和體液（尿液、血液）作為檢測(cè)樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

（1）多西環(huán)素儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）.準(zhǔn)確稱(chēng)取50.0 mg多西環(huán)素對(duì)照品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻密封，置-20 ℃冰箱中保存。

（2）多西環(huán)素-D3儲(chǔ)備液（100 μg/mL）。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 mg多西環(huán)素-D3對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻密封，置-20 ℃冰箱中保存。

（3）三氯乙酸（1 mol/L）。準(zhǔn)確稱(chēng)取16.3 g三氯乙酸置于100 mL容量瓶中，加入超純水溶解并定容至刻度，搖勻。

1.2.2 樣品處理

（1）組織。稱(chēng)取2.0 g勻漿后的組織樣品置于50 mL離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液（濃度5 μg/mL），靜置5 min。然后加入2 mL水、8 mL乙腈。渦旋混勻后，超聲提取10 min。然后室溫條件下4 000 r/min離心5 min，上清液倒入50 mL離心管中，加入500 mg C18吸附劑，渦旋30 s凈化。再重復(fù)離心1次，移取5 mL上清液在50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)屑尤? mL甲醇水（10∶90）、2 mL正己烷，渦旋30 s。室溫條件4 000 r/min下離心10 min，吸取下層過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

（2）尿液：取5 mL尿液樣品于15 mL離心管中，并加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液（濃度5 μg/mL），靜置10 min。將HLB萃取小柱固定在固相萃取裝置上，依次用5 mL甲醇、5 mL超純水活化后，倒入尿液樣品，用5 mL水、5 mL甲醇水（20∶80）淋洗，抽干，5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液。洗脫液在在50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)? mL甲醇水（10∶90）溶解，渦旋30 s。樣品過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

（3）血液。準(zhǔn)確吸取500 μL血漿，依次加入20 μL內(nèi)標(biāo)（5 μg/mL）、500 μL三氯乙酸溶液，渦旋混勻，10 000 r/min室溫條件下離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm針頭濾膜，待上機(jī)。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條 件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）；流速：0.25 mL/min；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～2 min，5%～15% B；2～5 min，15%～40% B；5～7 min，40%～95% B；7～7.1 min，95%～5% B；7.1～12 min，5%。柱溫為35 ℃。進(jìn)樣體積為10 μL。

（2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式；離子源溫度550 ℃；電噴霧電壓（IS）5.5 kV；氣簾氣壓力（CUR）、霧化氣壓力（GS1）及輔助氣壓力（GS2）分別為35 kPa、55 kPa和60 kPa。藥物優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 藥物的MRM質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 組織中多西環(huán)素殘留消除規(guī)律

不同時(shí)間點(diǎn)各組織中多西環(huán)素殘留量見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，10%多西環(huán)素可溶性粉按推薦劑量連續(xù)用藥5 d后，多西環(huán)素在肝臟和腎臟中的殘留含量最高，在肌肉、肺臟中的含量較低，停藥2 d后，多西環(huán)素在肌肉和肝臟的殘留量分別為（99.30±33.84）μg/kg和（104.51±29.20）μg/kg，均低于最高殘留量MRL[5]（肝臟300 μg/kg，肌肉100 μg/kg），停藥3 d后，腎臟中的多西環(huán)素殘留量為（350.28±136.12）μg/kg，低于了最高殘留量MRL（腎臟600 μg/kg）。多西環(huán)素主要?dú)埩舨课辉谀I臟，各組織中殘留消除的速度較快，在停藥后5 d，組織中均檢測(cè)不出多西環(huán)素。在停藥8 d采集的5頭豬血液中，只有1份樣品檢出多西環(huán)素。

表2 豬停藥后不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)各組織和尿液中多西環(huán)素的殘留濃度量（n=5）

2.2 休藥期計(jì)算

按照農(nóng)業(yè)部對(duì)多西環(huán)素最大殘留限量[5]和歐盟對(duì)休藥期計(jì)算方法，利用WT1.4軟件按雙單側(cè)99%置信區(qū)間計(jì)算多西環(huán)素在豬組織中休藥期[6]。由圖1可知，多西環(huán)素在肌肉中的休藥期為10.58 d、肝臟為10.80 d、腎臟為8.13d、肺臟為10.51 d，考慮到給藥方式等因素的影響，建議休藥期為11 d。

2.3 體液中多西環(huán)素殘留量相關(guān)性研究

通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS，對(duì)雙變量“停藥后體液中多西環(huán)素含量”“各組織中多西環(huán)素含量”進(jìn)行相關(guān)性分析。由表3可知，停藥后體液中多西環(huán)素殘留量與各組織中多西環(huán)素殘留量之間的相關(guān)系數(shù)大于0.85，相關(guān)系數(shù)的顯著性水平為0.01，體液與各組織中多西環(huán)素殘留量之間是高度相關(guān)的。

表3 體液與各組織中多西環(huán)素殘留量相關(guān)性

2.4 組織中藥物殘留量低于MRL時(shí)體液中殘留量區(qū)間預(yù)測(cè)

使用SPSS軟件對(duì)時(shí)間-體液中藥物濃度進(jìn)行線性分析，并根據(jù)建立的模型預(yù)測(cè)停藥為10.80 d時(shí)的體液中藥物濃度區(qū)間范圍。結(jié)果顯示，當(dāng)時(shí)間為10.80 d時(shí)，即肉豬體內(nèi)組織中多西環(huán)素殘留量低于最大殘留限量時(shí)，尿液中藥物濃度區(qū)間范圍為57.07～252.12 μg/L；血液中藥物濃度區(qū)間范圍為2.76～28.68 μg/L。

3 結(jié)論與討論

目前，常用的動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留檢測(cè)方法包括微生物法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法作為唯一確證方法應(yīng)用最多。龐國(guó)芳等[7]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了體內(nèi)各組織和體液中多西環(huán)素的殘留量，制定了該產(chǎn)品的休藥期為11 d，為藥物的臨床使用提供了數(shù)據(jù)支持。

注：A：肌肉，B：肝臟，C：肺臟，D：腎臟。

劉欣[3]按體重10 mg/kg的劑量給予鹽酸多西環(huán)素顆粒，每天1次，連續(xù)5 d，研究多西環(huán)素在動(dòng)物體內(nèi)的消除規(guī)律，結(jié)果顯示，停藥后第3天，除1頭豬肝臟組織中的殘留量高于MRL外，其他各組織中藥物的殘留量均低于MRL，同時(shí)計(jì)算休藥期為12 d[8-9]。而本試驗(yàn)結(jié)果中，停藥后第3天，豬各組織中藥物殘留量均低于MRL，計(jì)算休藥期為11 d，翟克影[4]也做了相關(guān)研究，除了劑型和給藥方式不同，鹽酸多西環(huán)素在豬體殘留分布與消除結(jié)果基本相似。

在實(shí)際生產(chǎn)中，通過(guò)對(duì)豬活體尿液樣品的檢測(cè)，建立的回歸方程，可以間接判斷豬體內(nèi)多西環(huán)素殘留量是否低于最大殘留限量。20世紀(jì)末開(kāi)始已有不少學(xué)者采用這種經(jīng)典回歸法來(lái)預(yù)測(cè)組織中藥物的殘留濃度，但在研究時(shí)均沒(méi)有考慮個(gè)體間差異，試驗(yàn)的重復(fù)性較差[10]。本文根據(jù)停藥后尿液、血液中藥物消除情況，引入置信區(qū)間預(yù)測(cè)，考慮了個(gè)體間差異，通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)當(dāng)動(dòng)物停藥時(shí)間到達(dá)休藥期時(shí)，尿液中多西環(huán)素殘留量區(qū)間下限為57.07 μg/L、血液為2.76 μg/L，表明可通過(guò)監(jiān)測(cè)體液中多西環(huán)素濃度判斷動(dòng)物體內(nèi)組織中藥物殘留量是否安全?？紤]到尿液樣品獲取更便捷，采取時(shí)動(dòng)物應(yīng)激更小，動(dòng)物屠宰前可檢測(cè)尿液判斷動(dòng)物是否符合屠宰要求，判定限為57 μg/L。