孔慶巖，胥小榮，龐 婕，王艷英，苗育可

（承德市食品藥品檢驗檢測中心，河北承德 067000）

食品安全是當(dāng)今社會非常關(guān)注的話題，而食品安全多是由于食源性致病菌所致，沙門氏菌是近年來食源性致病菌最主要原因之一，所以快速有效的檢測方法有利于減少食品安全的事件的發(fā)生。熒光PCR法檢測致病菌病源，以其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快和全封閉反應(yīng)等優(yōu)點而成為分子生物學(xué)研究中的重要工具[1-2]。傳統(tǒng)的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定沙門氏菌的檢驗需要前增菌、二次增菌、平板分離、生化鑒定及血清學(xué)分析等步驟，培養(yǎng)時間長，出具實驗結(jié)果需要至少5 d時間。其他如以抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測方法，如免疫酶實驗、免疫擴散法、乳膠凝集實驗、免疫熒光法及酶聯(lián)免疫吸附試驗等，使得沙門菌的檢測受到一些限制[3]。因此，快速、準(zhǔn)確、高效的檢測方法是大勢所趨，對快速及時發(fā)現(xiàn)致病菌，控制污染起到積極作用。目前最成熟的技術(shù)就是實時定量PCR檢測致病菌病源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢驗食品：熟肉制品、糕點和餐飲常見食品等。沙門氏陽性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：乙型副傷寒沙門氏菌；非沙門菌陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大腸埃希氏菌O157:H7；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）；旋達(dá)R1致病菌生物檢測系列“沙門氏菌核酸檢驗試劑盒”（雙螺旋基因公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

實時熒光定量PCR儀（CFX96TMOptics Moduie，BIORAD）；高速離心機（HC-1016，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；生物安全柜（SC1100ⅡB2-X，生濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA制備

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株。①取沙門氏菌復(fù)壯菌液1 mL于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。②用PBS將沉淀的菌體洗滌2次，加入100 μL已滅菌超純水中，于100 ℃水浴15 min。③-20 ℃放置30 min。④37 ℃解凍后，用離心機12 000 r/min離心5 min，取得的上清液為沙門氏菌的DNA。

（2）TIANGEN細(xì)菌基因組使用DNA提取試劑盒提取。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.2 食品樣品DNA提取

致病菌是活的生物物質(zhì)，為了得到大量的可檢測致病菌，可以取一定量食品在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增菌。培養(yǎng)增菌還可以簡化介質(zhì)，減少復(fù)雜食品介質(zhì)對PCR的抑制影響。①稱取25 g（mL）樣品加入到225 mL緩沖蛋白胨水BPW增菌液培養(yǎng)基中，36 ℃增菌培養(yǎng)18 h。②取出1 mL增菌培養(yǎng)后的樣品于1.5 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min。③將上清液用移液槍轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，用離心機12 000 r/min離心5 min。④棄去上清液，用PBS懸浮菌體，離心洗滌2次。⑤提取細(xì)菌基因組DNA。

1.3.3 實時熒光定量PCR擴增

（1）添加模板。剪下所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30 s后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5 μL模板，順序為空白、陰性對照、待測樣品模板、陽性對照。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30 s，離心1 min，立即進行PCR擴增反應(yīng)。

（2）擴增反應(yīng)。使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。

（3）PCR反應(yīng)條件。①預(yù)變性：95 ℃，10 min，1個循環(huán)。②擴增：95 ℃，15 s；60 ℃，45 s。40個循環(huán)。在60 ℃時收集熒光。熒光通道選擇FAM。

1.3.4 結(jié)果判斷

①檢測樣品Ct≥40.0，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，樣品陰性，不含沙門氏菌。②檢測樣品Ct≤35.0，曲線為“S”型擴增曲線，樣品陽性，含有沙門氏菌。③檢測樣品35.0＜Ct＜40.0，需進行一次重復(fù)實驗。

為確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進行實際樣品檢測時，設(shè)立空白對照、陰性對照和陽性對照實驗。實時熒光PCR反應(yīng)體系，在檢驗區(qū)進行檢測，檢測結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線盒Ct值判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

對一株沙門氏菌和3株非沙門氏菌及30個食品樣品，用建立的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。由圖1知，沙門氏菌的檢測結(jié)果為陽性，而非沙門氏菌檢測可知，結(jié)果為陰性，食品樣本為陰性，PCR方法比較傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)方法更具時效性的優(yōu)勢，通過此次檢驗數(shù)據(jù)結(jié)果的比較，表明建立的實時熒光定量PCR檢測技術(shù)具有良好的的靈敏性、時效性和特異性，PCR方法和傳統(tǒng)方法對比檢測結(jié)果見表1。

圖1 沙門氏菌 PCR陽性曲線

表1 PCR方法和傳統(tǒng)方法對比檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

該方法采用BPW對目標(biāo)菌沙門氏菌和3種非沙門氏菌進行增菌，按直接提取法提取DNA模板，提高了檢測效率，節(jié)省檢測費用，方法特異性強、靈敏度高，能滿足食品微生物的快速檢測。由于PCR實驗中退火溫度對結(jié)果影響較大，通過優(yōu)化，最佳退火溫度設(shè)置為60 ℃，在該條件下，5種菌均能擴增出清晰條帶，沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157:H7和金黃色葡萄球菌在多重PCR中能檢測出[4-5]。

在沙門氏菌的快速檢驗中，實時熒光定量PCR技術(shù)占有重要地位。它已成為保障食品安全，鑒定相應(yīng)食源性致病菌的有力工具，相對于傳統(tǒng)檢驗方法，具有自動化程度高、污染性小、實時性和準(zhǔn)確性等特點，大大提高了檢測的效率，節(jié)省了檢測的人力、物力和財力。隨著研究的不斷深入，該方法會得以發(fā)展和完善，在沙門氏菌的檢測中發(fā)揮更大作用，但仍存在一定不足，PCR本身靈敏度高，操作過程中存在系統(tǒng)誤差、環(huán)境污染等問題，如樣品間的交叉污染、外源性污染等其他污染，造成結(jié)果會產(chǎn)生假陽性。由于此方法是對基因片段進行檢測，無法自動識別活菌與死菌，要求前處理過程需要有效控制，樣品、試劑本身和設(shè)備等條件會抑制PCR酶反應(yīng)。