胡 莎，袁 夢(mèng)，葛文靜，林翠蘋，于業(yè)志

（1.青島市糧油質(zhì)量檢測(cè)和軍隊(duì)糧油供應(yīng)中心，山東青島 266000；2.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東青島 266000；3.青島菲優(yōu)特檢測(cè)有限公司，山東青島 266000）

真菌毒素污染是威脅糧食安全的重要因素，糧食在種植、加工、儲(chǔ)存及流通等環(huán)節(jié)中可能被真菌毒素污染[1]，最新發(fā)布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定了谷物及其制品中對(duì)黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFT B1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、赭曲霉毒素A（Orchatoxin A，OTA）及玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的限量指標(biāo)[2-3]，這4種真菌毒素是目前為止認(rèn)為可能對(duì)人們的健康構(gòu)成較大風(fēng)險(xiǎn)的[3-7]。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)糧油產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法一般常見的有膠體金快速檢測(cè)法[8-9]、薄層色譜法[10]、酶聯(lián)免疫法[11]、高效液相色譜法[12]及液相液質(zhì)聯(lián)用法[13]。

本文旨在建立多功能柱凈化、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定小麥中DON、OTA、AFT B1和ZEN共4種真菌毒素的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-QQQ 1290-6460，安捷倫科技有限公司）；離心機(jī)（Sartorius sigma 3-18k）振 蕩 器（Heidolph Multi Reax）；電 子 天 平（Sartorius）；MycoSpinTM 400 Multitoxin凈 化 柱（Romer Labs公司）；微型聚四氟乙烯濾膜（0.22 μm）。

超純水（娃哈哈）；乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純）、甲醇（色譜純），德國(guó)merck公司；標(biāo)準(zhǔn)溶液DON（100.6 mg/L）、ZEN（100.4 mg/L）、AFT B1（100.3 mg/L）、OTA（100.1 mg/L），Pribolab公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

稱取25 g（精確至0.001 g）樣品于250 mL具塞三角瓶中，加入100 mL乙腈/水（50/50，V/V），放置于震蕩器中混合90 min，靜置1 min后過濾，吸取10 mL濾液于50 mL聚丙烯離心管中，并加入500 μL乙酸混勻，從混合液中移取750 μL至MycoSpinTM 400凈化柱，蓋緊凈化柱振蕩混合1 min，凈化柱底端將凈化柱放入離心管中，轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心30 s，取上清液過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 溶液的配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。將4種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 依 次 稀 釋 成DON（100 μg/mL）、ZEN（100 μg/mL）、AFT B1（4.0 μg/mL）、OTA（2 μg/mL）的單標(biāo)儲(chǔ)備液，分別吸取1 500 μL、200 μL、250 μL、1 000 μL的DON、ZEN、OTA、AFT B1單標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度分別為15.0 μg/mL、2.0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。分別準(zhǔn)確移取25 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL和1 000 μL混標(biāo)溶液于10 mL容量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑（乙腈-水-乙酸混合液35.0∶64.5∶0.5，體積比）定容至刻度，各標(biāo)準(zhǔn)具體濃度見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度（單位：μg/L）

1.2.3 色譜分離條件

色譜柱C18柱（1.8 μm，100 mm×3.0 mm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：4 μL；流動(dòng)相A：1%乙酸溶液＋5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B：甲醇，流動(dòng)相梯度見表2。

表2 液相色譜分離梯度條件

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓：4 kV（＋）3.5 kV（－）；干燥氣溫度：350 ℃；霧化氣電壓：40 psi；干燥氣流量：10 L/min；碰撞氣：氮?dú)猓粧呙枘Ｊ剑憾喾磻?yīng)監(jiān)測(cè)MRM；駐留時(shí)間：30 ms；

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

流動(dòng)相對(duì)檢出目標(biāo)物質(zhì)的分離度、響應(yīng)值、峰型及離子化效率都有影響，根據(jù)現(xiàn)有的檢測(cè)這4種毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)顯示流動(dòng)相一般采用甲酸水溶液/乙腈，乙腈/乙酸銨，乙腈/甲酸/甲酸銨，乙腈/水，乙酸銨/甲醇-乙腈，結(jié)合需檢出的這4種真菌毒素的結(jié)構(gòu)特性，一般在ESI正負(fù)離子模式下[M+H]+、[M-H]-、[M-CH3COO]-、[M+NH4]+離子峰形式出現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)選定流動(dòng)相為1%乙酸溶液＋5 mmol/L乙酸銨水溶液/甲醇對(duì)4種真菌毒素能夠有很好的分離效果。

2.1.2 色譜柱的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了兩種色譜柱Eclispse Plus C18（2.1mm×50 mm，1.8 μm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）對(duì)4種真菌毒素的分離效果，同樣的色譜條件下后一種色譜柱分離效果更佳。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 母離子的選擇和碎裂電壓的優(yōu)化

將真菌毒素單標(biāo)溶液直接連接質(zhì)譜進(jìn)樣1 μL，分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行MS2 Scan全掃描，確定各毒素母離子質(zhì)量數(shù)。然后進(jìn)行MS2 SIM選擇離子監(jiān)測(cè)，優(yōu)化碎裂電壓。

2.2.2 子離子的選擇和碰撞能量的優(yōu)化

設(shè)置母離子質(zhì)量數(shù)和MS2的掃描范圍，進(jìn)行Product Ion Scan 子離子掃描，將響應(yīng)最高的確定為定量離子，次之確定為定性離子，并優(yōu)化碰撞能量CE。優(yōu)化完成后進(jìn)行MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，主要參數(shù)見表3。

表3 質(zhì)譜條件

2.3 線性范圍與檢出限

由表4可知，4種真菌毒素在標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，以3倍和10倍信噪比分別確定目標(biāo)物的檢出限和定量限。

表4 4種真菌毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 回收率與精密度

在空白樣品中添加低、中、高3個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，3水平重復(fù)測(cè)定6次，加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表5。3水平加標(biāo)回收率在86.6%～110.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0%～18.7%，由此可見，方法具有良好的精密度。

表5 4種真菌毒素的加標(biāo)回收率和精密度

3 結(jié)論

本文采用乙腈水提取小麥中4種常見真菌毒素，MycoSpinTM400 Multitoxin 凈化柱凈化，能有效的去除小麥基質(zhì)中的雜質(zhì)，減少基質(zhì)效應(yīng)，采用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用MRM模式進(jìn)行檢測(cè)，該方法高效快捷、操作簡(jiǎn)單、回收率高，精密度與準(zhǔn)確度好，適合同時(shí)測(cè)定小麥中4種真菌毒素。