朱圣輝，廖乘勝，施旭東，楊鵬，張圣賢

（寧波舜宇儀器有限公司，浙江 寧波 315408）

據(jù)全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查［1］，2010 年我國15 歲及以上人群活動性肺結(jié)核的患病率為459/10 萬，涂陽肺結(jié)核患病率為66/10 萬，我國仍是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家。對于結(jié)核的實驗室檢查，目前可以用到的方法有很多，比如細(xì)菌學(xué)檢測中的直接涂片法和培養(yǎng)法，分子檢測中的GENE XPERT，免疫學(xué)檢測中的結(jié)核菌素試驗皮試，免疫球蛋白（IgG）檢測，T 細(xì)胞斑點試驗（T-SPOT.TB）檢測等［2-4］。而細(xì)菌學(xué)檢測中的痰涂片檢查由于其操作簡便，結(jié)果直觀，成本低廉優(yōu)勢，一直都是實驗室檢查中的常用方法，涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，是結(jié)核診斷的有力證據(jù)［5-6］。

目前的痰涂片鏡檢的常用方法是萋-尼抗酸染色法，操作要求［7-8］鏡檢人員用100X 油鏡觀察每張玻片的50～300 個不同視野，特別是對于弱陽或陰性的標(biāo)本，實驗室質(zhì)控要求至少觀察300 個視野，這對鏡檢人員而言是很大的負(fù)擔(dān)，并且非常容易發(fā)生漏檢。而結(jié)核桿菌掃描儀可以掃描每張片子的至少300 個視野，并通過算法進(jìn)行輔助診斷，極大的減輕了人工鏡檢的工作量。為驗證掃描儀的檢驗性能，本研究收集了痰液標(biāo)本1 266例，采用人工直接涂片法和萋-尼抗酸染色法，隨后對比人工鏡檢的結(jié)果和設(shè)備掃描的結(jié)果，以液體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，研究掃描儀對于抗酸桿菌檢出的敏感性和特異性，探討掃描儀的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 中國寧波舜宇儀器有限公司生產(chǎn)光學(xué)顯微鏡EX30，采用100X 油鏡觀察；中國寧波舜宇儀器有限公司生產(chǎn)結(jié)核桿菌顯微掃描儀FS50。

1.1.2 試劑 中國珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)抗酸染色液與痰消化液，美國BD 公司生產(chǎn)MGIT 培養(yǎng)試劑。

1.2 實驗過程

中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院2019 年3 月至6 月的結(jié)核門診患者1 266 例，按照標(biāo)準(zhǔn)［9］采集膿樣痰，干酪樣或粘液3～5 mL。

標(biāo)本制備：用折斷的竹簽茬端挑取標(biāo)本中干酪樣，膿樣或可疑部分在一張玻片上涂抹成10×20 mm 的卵圓形痰膜，隨后采用萋-尼抗酸染色法進(jìn)行抗酸染色［5］。

鏡檢：染色后的片子晾干后放至結(jié)核桿菌顯微掃描儀進(jìn)行掃描和結(jié)果判讀。將染色晾干后的涂片放入掃描儀的料盒，料盒放入掃描儀主機(jī)后選中需要掃描的標(biāo)本進(jìn)行掃描，隨后在軟件閱片界面進(jìn)行結(jié)果審閱和記錄；機(jī)器判讀完成后，由經(jīng)驗豐富的結(jié)核實驗室工作者對片子進(jìn)行人工顯微鏡觀察，在100X 油鏡下連續(xù)觀察300 個不同視野，結(jié)核分枝桿菌在藍(lán)色背景下呈細(xì)長略帶彎曲的紅色桿狀。

結(jié)核桿菌顯微掃描儀工作原理：通過對痰涂片進(jìn)行顯微掃描，并對掃描圖像進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的識別，分類，最終提供輔助診斷結(jié)果。

結(jié)果判讀：萋-尼染色抗酸桿菌陰性：未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（報告條數(shù)））：抗酸桿菌菌數(shù)1～8 條/300 視野；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（1+）：3～9 條/100 視野，連續(xù)觀察300 個視野；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（2+）：1～9 條/10 視野，連續(xù)觀察100 個視野；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（3+）：1～9 條/1 視野；萋-尼染色抗酸桿菌陽性（4+）：≥10 條/1 視野。報告1+時至少觀察300 個視野，報告2+至少觀察100 個視野，3+、4+時至少觀察50 個視野。

液體培養(yǎng)：剩余痰液標(biāo)本采用BACTEC MGIT分枝桿菌檢測儀進(jìn)行培養(yǎng)檢測。在標(biāo)本中加入與標(biāo)本等量的NALC-NaOH 混合溶液；旋緊蓋子后渦旋震蕩30 s，室溫靜置15～20 min，勿超過20 min，以防殺死結(jié)核菌。在液化后的標(biāo)本中加入pH6.8 的PBS 緩沖液至40～45 mL，3 000 g 離心15 min，緩慢倒棄上清液至廢液瓶。加入1～3 mL pH6.8 的PBS 緩沖液，重懸沉淀，處理后的標(biāo)本接種到相應(yīng)的培養(yǎng)管內(nèi)進(jìn)行液體培養(yǎng)。

結(jié)果判讀：如果儀器報告陽性，應(yīng)按照液體培養(yǎng)基的要求對培養(yǎng)液進(jìn)行涂片染色鏡檢。如果涂片檢查為抗酸菌陽性，則報告培養(yǎng)陽性；如果難以確定，可用革蘭染色法判定。如果涂片檢查發(fā)現(xiàn)有非抗酸菌存在，則報告污染。如果任何微生物皆未發(fā)現(xiàn)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)；6 周培養(yǎng)儀器未報告陽性，則判定為培養(yǎng)陰性。如果抗酸染色陰性且沒有明顯污染的培養(yǎng)管，可以繼續(xù)觀察，幾天后，重復(fù)抗酸涂片［10-11］。

質(zhì)量控制：要求每一批次涂片染色都要做陽性對照和陰性對照。用結(jié)核分枝桿菌（H37Rv,ATCC27294）作陽性對照。其他細(xì)菌如大腸桿菌的菌懸液可作為陰性對照。陽性對照的抗酸染色結(jié)果呈陽性，而陰性對照的抗酸結(jié)果為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用t檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示。約登指數(shù)=靈敏度+特異度?1。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

顯微掃描設(shè)備的平均檢測時間為（1.5±0.2）min/例標(biāo)本，人工鏡檢組為（4.2±1.1）min/例標(biāo)本，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。以BD 液體培養(yǎng)法檢測結(jié)果為診斷結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核桿菌顯微掃描儀的靈敏度和特異度分別為51.56%和96.94%，人工鏡檢的靈敏度和特異度分別為43.23% 和99.66%。顯微掃描儀的尤登指數(shù)為0.49，人工鏡檢的尤登指數(shù)為0.43。見表1。

表1 儀器鏡檢與人工鏡檢結(jié)果比較（例）

3 討論

抗酸涂片檢查是結(jié)核病實驗室最常用的檢測方法之一，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，是診斷分枝桿菌的有力證據(jù)。因此萋-尼抗酸染色法常用于結(jié)核病的診斷［12］。傳統(tǒng)的萋-尼抗酸染色法流程是人工涂片染色，隨后人工鏡檢［13］。整體實驗流程費(fèi)時費(fèi)力［14-15］，特別是人工鏡檢環(huán)節(jié)，按要求，每個實驗人員每個工作日閱片量不能超過25 片，且連續(xù)閱片10～12 張后應(yīng)休息20 min。但在實際工作中，很多結(jié)核病實驗室工作人員工作量大，經(jīng)常存在單日閱片量超過25 張的情況。

以培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而比較結(jié)核桿菌顯微掃描設(shè)備和人工鏡檢的檢測效率。顯微掃描設(shè)備與人工鏡檢的靈敏度分別為51.56% 和43.23%，特異度分別為96.94% 和99.66%，約登指數(shù)分別為0.49 和0.43。顯微掃描儀的診斷效率高于人工鏡檢。

本研究的1 266 例標(biāo)本中，有58 例標(biāo)本兩種檢測方法不一致，其中54 例標(biāo)本人工鏡檢為陰性，結(jié)核桿菌顯微掃描儀陽性，4 例標(biāo)本顯微掃描儀結(jié)果陰性而人工鏡檢為陽性。查找實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這58 例標(biāo)本的陽性等級范圍都在1 條/300 視野至1+，其中顯微掃描儀漏檢的4 例標(biāo)本，人工鏡檢結(jié)果分別為1 條/300 視野，1 條/300 視野，2 條/300 視野，3 條/300 視野。分析漏檢原因，結(jié)核桿菌顯微掃描儀只掃描300 個視野，而10×20 mm 的卵圓形的痰膜整體視野數(shù)量在5 000 個以上，因此陽性級別較低的標(biāo)本可能會因為視野盲區(qū)而產(chǎn)生漏檢。如果增加掃描視野數(shù)量，就可以增加掃描儀的檢出率，降低漏檢率。分析人工鏡檢的漏檢原因，主要有兩點：一是視野盲區(qū)，二是鏡檢操作人員由于觀察遺漏和視覺疲勞。對比人工鏡檢和掃描儀的漏檢數(shù)量，兩種方法的每個標(biāo)本視野數(shù)量基本一致，因此造成人工漏檢的主要原因是第二點。

綜上所述，結(jié)核桿菌顯微掃描儀鏡檢與人工鏡檢均屬于形態(tài)學(xué)鏡檢，顯微掃描儀鏡檢與人工鏡檢的特異度比較差異不明顯，敏感性上優(yōu)于人工鏡檢，且極大的縮短了鏡檢時間，大大減輕了操作人員的工作量。因此結(jié)核桿菌顯微掃描儀用于結(jié)核實驗室涂片找抗酸桿菌的篩查，適宜在各級結(jié)核病實驗室進(jìn)行推廣應(yīng)用。