趙國(guó)棟，洪璐，王倪，何玲，張善堂，陳衛(wèi)東*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 300；.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 30038；3.安徽省立醫(yī)院，合肥 3000）

腦絡(luò)欣通方（Naoluo Xintong decoction，NLXTD）是新安醫(yī)學(xué)用于中風(fēng)治療的臨床驗(yàn)方，由黃芪、川芎、三七等七味中藥按照君臣佐使理論配伍而成。全方活血寓于補(bǔ)氣之中，氣貫經(jīng)脈以助血行，營(yíng)血流暢經(jīng)脈得養(yǎng)，臨床療效顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明腦絡(luò)欣通方治療缺血性中風(fēng)療效顯著，在促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，減小腦梗死體積，改善腦缺血再灌注損傷伴有的局部過(guò)度炎性反應(yīng)等方面體現(xiàn)出顯著的治療優(yōu)勢(shì)[1-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，腦絡(luò)欣通方應(yīng)用于臨床多以湯劑的形式，其療效確切、易吸收、起效迅速[4]。但湯劑存在劑量不準(zhǔn)確，藥效不穩(wěn)定，服用量大，攜帶和運(yùn)輸不便，不易保存等缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用和發(fā)展，故需要改進(jìn)劑型。

響應(yīng)面法（RSM）是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模，通過(guò)對(duì)具有代表性的局部各點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，回歸擬合全局范圍內(nèi)因素與結(jié)果間的函數(shù)關(guān)系，取得各因素最優(yōu)水平值的優(yōu)化方法；具有試驗(yàn)次數(shù)少、精密度高、模型預(yù)測(cè)性能好、可用于研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[5]。熵權(quán)法（EWM）則是經(jīng)過(guò)對(duì)試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計(jì)算和分析，進(jìn)而得出各項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)[6]。采用兩者結(jié)合的方式優(yōu)化中藥提取工藝，既可以系統(tǒng)地對(duì)影響中藥提取工藝的各因素及因素間相互作用進(jìn)行研究，又有利于降低人為主觀因素造成的試驗(yàn)結(jié)果偏差，使試驗(yàn)結(jié)果更具有科學(xué)性和合理性。

基于此，為更好地進(jìn)行腦絡(luò)欣通方的新藥開(kāi)發(fā)工作，本研究依據(jù)中藥新藥研發(fā)的相關(guān)要求，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，采用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，選擇腦絡(luò)欣通方提取液中3 種成分（羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸）的含量及復(fù)方出膏率作為考察指標(biāo)，運(yùn)用熵權(quán)法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，旨在優(yōu)選出腦絡(luò)欣通方提取工藝的最佳工藝參數(shù)，為其劑型改進(jìn)提供試驗(yàn)依據(jù)，并為該方進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20ADXR 液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；電子天平（型號(hào)：PA1004B，上海越平科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號(hào)：WB-2000，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（型號(hào)：KQ2200，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；CP2250 分析天平（精度：0.01 mg，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）。

1.2 試藥

羥基紅花黃色素A（批號(hào)：R25A9F 59977）、毛蕊異黃酮苷（批號(hào)：Y27F9H 54731）（對(duì)照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院）；液相用乙腈為色譜純，水為超純水，其他化學(xué)試劑均為分析純。黃芪（批號(hào)：200601）、紅花（批號(hào)：200601）、三七（批號(hào)：200601）、川芎（批號(hào)：200601）、天麻（批號(hào)：200601）、當(dāng)歸（批號(hào)：200601）（安徽友信藥業(yè)有限公司），蜈蚣（批號(hào)：160801，安徽亳州廣印堂中藥有限責(zé)任公司），均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定其為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備[7]

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定羥基紅花黃色素A 2.38 mg、毛蕊異黃酮苷1.00 mg、阿魏酸1.00 mg 對(duì)照品置于5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制成含羥基紅花黃色素A 476.00 μg·mL－1、毛蕊異黃酮苷200.00 μg·mL－1、阿魏酸200.00 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 按照腦絡(luò)欣通方藥材比例稱(chēng)取藥材40 g（黃芪∶川芎∶三七∶天麻∶當(dāng)歸∶紅花∶蜈蚣＝15∶5∶3∶5∶5∶5∶2），精密稱(chēng)定，將除蜈蚣以外的其余藥材全部置于圓底燒瓶中，精密加入8 倍量超純水浸泡30 min，回流提取1 h，趁熱用紗布過(guò)濾，得到藥渣與煎出液，重復(fù)一次，合并提取液；將蜈蚣研磨成粉狀物加入提取液中，將混勻的提取液低速離心（3000 r·min－1，10 min），取上清液經(jīng)布氏漏斗抽濾得濾液，棄去濾渣，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 mL 含生藥0.5 g；精密量取4 mL 濃縮液加入6 mL 無(wú)水乙醇，靜置沉淀24 h，取上清液1 mL 用5%的乙腈稀釋2 倍，過(guò)0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比，分別稱(chēng)取除紅花以外、除黃芪以外以及除川芎、當(dāng)歸以外的其他藥材，按制備工藝制成復(fù)方水提液，再按“2.1.2”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Unitary C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%的磷酸水（B）；梯度洗脫程序：0～18 min，5%～17%A；18～28 min，17%～20%A；28～40 min，20%～25%A；40～45 min，25%～90%A；45～55 min，90%A；55～60 min，90%～5%A。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性考察 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷及阿魏酸均能與其他組分達(dá)到基線分離，各吸收峰的理論塔板數(shù)均不低于5000，且陰性樣品溶液無(wú)干擾（見(jiàn)圖1）。

圖1 混合對(duì)照品（A）、供試品（B）、缺紅花陰性樣品（C）、缺黃芪陰性樣品（D）及缺川芎、當(dāng)歸陰性樣品（E）的HPLC 圖Fig 1 HPLC of mixed reference substance（A），sample（B），negative sample without Carthami Flos（C），negative sample without Astragali Radix（D），and negative sample without ChuanXiong Rhizoma and Angelicae Sinensis Radix（E）

2.3.2 線性關(guān)系考察 以“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液作為母液，進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瞥梢幌盗匈|(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。羥基紅花黃色素A：Y＝1.28×104X＋1.84×105，r＝0.9998；毛蕊異黃酮苷：Y＝3.84×104X－1.10×105，r＝0.9999； 阿魏酸Y＝3.79×104X－2.59×105，r＝0.9999；羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸在46.648～466.480 μg·mL－1、19.600～196.000 μg·mL－1、19.600～196.000 μg·mL－1與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 精密度考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸峰面積RSD分別為0.67%、0.08%、0.06%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液6 份，分別放置0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣。計(jì)算羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸峰面積RSD分別為1.2%、1.4%、2.0%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 選取同一批藥材，按腦絡(luò)欣通方藥材比例稱(chēng)取藥材40 g，精密稱(chēng)取6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，記錄羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸的色譜峰面積，RSD值分別為1.5%、1.8%、1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取已測(cè)定的同一批藥材，按腦絡(luò)欣通方中藥材的比例精密稱(chēng)取藥材40 g，共6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備提取液，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液，制得供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，羥基紅花黃色素A 平均回收率為99.4%，RSD為1.3%；毛蕊異黃酮苷的平均回收率為100.1%，RSD為1.5%；阿魏酸的平均回收率為100.3%，RSD為1.3%，說(shuō)明該方法回收率良好。

2.4 出膏率測(cè)定

精密量取供試品溶液40 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于真空干燥箱中烘干至恒重，取出，移置干燥器中，冷卻，迅速稱(chēng)重，計(jì)算出膏率。

2.5 單因素試驗(yàn)

按照腦絡(luò)欣通方藥材比例稱(chēng)取藥材40 g，加入10 倍量的超純水，考察不同浸泡時(shí)間（20、30、40、50、60 min），提取時(shí)間（30、60、90、120 min），提取次數(shù)（1、2、3、4 次），對(duì)腦絡(luò)欣通方中羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸的含量及浸膏得率的影響。結(jié)果表明：各項(xiàng)指標(biāo)的高低受浸泡時(shí)間、提取時(shí)間及提取次數(shù)影響顯著，直觀分析確定浸泡時(shí)間最優(yōu)值在40～60 min 內(nèi)，最優(yōu)提取時(shí)間在60～120 min 內(nèi)，最優(yōu)提取次數(shù)在2～4 次內(nèi)，故選三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。

2.6 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.6.1 Box-Behnken 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 選擇水為提取溶劑，以提取時(shí)間（x1）、提取次數(shù)（x2）、浸泡時(shí)間（x3）為考察因素，羥基紅花黃色素A 含量（y1）、毛蕊異黃酮苷含量（y2）、阿魏酸含量（y3）及出膏率（y4）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab 1 Response surface test design

2.6.2 信息熵法對(duì)數(shù)據(jù)的分析[8]信息熵是系統(tǒng)不確定性和無(wú)序程度的度量，除了度量數(shù)據(jù)包含的信息量，還可在多指標(biāo)評(píng)價(jià)系統(tǒng)中用于確定各指標(biāo)權(quán)重。該法是將每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)作為一個(gè)隨機(jī)變量，計(jì)算該指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)，其取值變異程度越大，越無(wú)序，提供的信息量越多，該指標(biāo)就越重要；反之該指標(biāo)就越不重要。用熵權(quán)法確定權(quán)重的計(jì)算步驟如下：

① 指標(biāo)歸一化處理：設(shè)m個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)n個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象的原始數(shù)據(jù)矩陣為X＝（aij）mn，對(duì)其歸一化后得到X’＝（xij）mn，對(duì)正向指標(biāo)而言，按照以下公式進(jìn)行歸一化。

X’ij＝（aij－min j {aij}）/（max j {aij}－min j {aij}），X’ij表示第i次試驗(yàn)時(shí)第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的取值，i＝1，2，3，…，m；j＝1，2，3，…，n。

② 將原始數(shù)據(jù)陣（aij）mn轉(zhuǎn)換為概率矩陣（Pij）mn；在信息熵公式中Pi為某個(gè)信息的概率，滿(mǎn)足0 ≤Pi≤1，因此必須先對(duì)矩陣（aij）mn進(jìn)行歸一化處理，經(jīng)處理后的矩陣可視為評(píng)價(jià)指標(biāo)的概率矩陣。其中Pij表示第j次試驗(yàn)在第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)下的概率。

③ 計(jì)算指標(biāo)的熵值，確定第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的信息熵（Hi）。

④ 計(jì)算指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)（Wj）。

運(yùn)用Design-Expert 10 軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，得到提取時(shí)間（x1）、提取次數(shù)（x2）、浸泡時(shí)間（x3）與綜合評(píng)分（Y）之間的二次多元回歸模型方程：

表2 各指標(biāo)熵值及權(quán)重系數(shù)Tab 2 Entropy value and weight coefficient of each index

Y＝0.33 － 0.061x1－ 0.061x2＋0.08x3＋0.12x1x2－ 0.17x1x3－ 0.19x2x3＋0.064x12＋0.089x22－3.750×10－3x32

對(duì)綜合評(píng)分值模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果方程決定系數(shù)r2＝0.9502，表明該回歸模型的擬合情況良好。由二次回歸模型方差分析結(jié)果（見(jiàn)表3）可知，該模型具有高度顯著性，可信度高，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型擬合度較好，可以對(duì)不同條件下的目標(biāo)指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis

2.6.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝 根據(jù)擬合的二次回歸模型，采用Design-Expert 10 軟件繪制綜合評(píng)分值隨因素變化的三維曲面圖和等高線圖，如圖2所示。圖2A 顯示浸泡時(shí)間為50 min 的條件下，提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分值的影響，提取時(shí)間的最優(yōu)區(qū)域是60～120 min，提取次數(shù)的最優(yōu)區(qū)域是2～4 次。圖2B 顯示提取時(shí)間為90 min的條件下，浸泡時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響，浸泡時(shí)間的最優(yōu)區(qū)域是40～60 min，提取次數(shù)的最優(yōu)區(qū)域是2～4 次。圖2C 顯示提取次數(shù)為3 次的條件下，浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分值的影響，浸泡時(shí)間的最優(yōu)區(qū)域是30～50 min，提取時(shí)間的最優(yōu)區(qū)域是60～120 min。

圖2 不同因素對(duì)綜合評(píng)分值影響的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig 2 Contour map and response surface map of influence of different factors on the comprehensive scores

2.6.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合二次回歸方程，求解得到最佳工藝條件為提取74.53 min，浸泡59.94 min，提取2.20 次（綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值0.850）?？紤]到實(shí)際工藝生產(chǎn)，求得的最佳工藝條件均取整數(shù)，即提取74 min，浸泡60 min，提取2 次。在該工藝下平行試驗(yàn)3 次，測(cè)定指標(biāo)成分含量和出膏率。實(shí)測(cè)綜合評(píng)分值分別是0.824、0.870、0.815，與預(yù)測(cè)值之間的RSD均小于3%，證明該工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

以往的復(fù)方提取工藝研究，較多是對(duì)料液比、提取時(shí)間及提取次數(shù)進(jìn)行考察。在預(yù)試驗(yàn)中選擇8 倍、10 倍、12 倍的料液比在其他因素相同的條件下分別提取。結(jié)果顯示，3 組所得樣品的指標(biāo)成分含量及出膏率并沒(méi)有體現(xiàn)出顯著差異。考慮到腦絡(luò)欣通方中有效成分大多為親水性成分，如羥基紅花黃色素A，相較于料液比，浸泡時(shí)間產(chǎn)生的影響往往更大。因此，本試驗(yàn)選擇浸泡時(shí)間、提取時(shí)間及提取次數(shù)作為考察因素。

在考察指標(biāo)的選擇中，考慮到毛蕊異黃酮苷是黃芪改善缺血性腦卒中的重要活性成分[9-10]，具有促進(jìn)血管新生，增加缺血再灌注大鼠腦細(xì)胞中膜的流動(dòng)性等作用。阿魏酸為當(dāng)歸和川芎的指標(biāo)成分[11]，具有抗血小板聚集、解除血管平滑肌痙攣、抗氧化和清除氧自由基、提高膜穩(wěn)定性等藥理作用[12]。羥基紅花黃色素A 是紅花中的主要活性成分，具有活血、化瘀、通脈的功效，能夠有效治療缺血性腦卒中[13]。此外，在高效液相色譜圖中也能直觀發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷及阿魏酸具有相對(duì)較高的峰面積，色譜峰易于辨識(shí)。浸膏作為中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，出膏率的變化往往影響有效成分的含量變化，從而影響中藥復(fù)方的藥效。綜上，本試驗(yàn)選取羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸3 個(gè)活性成分含量以及出膏率作為考察指標(biāo)。

除考察指標(biāo)的選擇外，各項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)同樣影響著試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。依據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)主觀賦權(quán)往往會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，缺乏科學(xué)性與合理性。本試驗(yàn)基于熵權(quán)法計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的綜合權(quán)重，結(jié)果更具有穩(wěn)定性和可靠性，能夠?yàn)槟X絡(luò)欣通方提取工藝研究提供參考。