劉子源，譚澤明，譚佳琪，薛宏坤（.河北省廊坊市體育運(yùn)動(dòng)學(xué)校，河北 廊坊 065000；.北京大學(xué)前沿交叉研究院，北京 00084；3.清華大學(xué)工程物理系，北京 00084）

隨著生活水平的提高和飲食方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年增加，其中2 型糖尿病占糖尿病患者的90%以上。2 型糖尿病屬于低度慢性炎癥性疾病，而通過(guò)糖尿病誘發(fā)的血管病變是導(dǎo)致糖尿病患者致殘、致死的主要原因之一[1]。已有研究證實(shí)2型糖尿病及因糖尿病引起的血管并發(fā)癥與炎癥密切相關(guān)[2]。脂質(zhì)代謝紊亂、高血糖、氧化應(yīng)激和胰島素抵抗等因素均會(huì)導(dǎo)致糖尿病發(fā)生，進(jìn)而誘導(dǎo)血管炎癥的發(fā)生[3]。其中氧化應(yīng)激和高血糖均可以直接激活經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，誘發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活下游的炎癥相關(guān)基因。因此，有效降低血管氧化應(yīng)激程度，抑制炎癥相關(guān)的信號(hào)對(duì)緩解糖尿病血管并發(fā)癥具有重要意義。目前，臨床上還沒(méi)有比較完善的治療糖尿病的方法，主要以控制患者血糖為主，2 型糖尿病患者常服用雙胍類藥物來(lái)達(dá)到控制血糖的目的。糖尿病本身并不可怕，其并發(fā)癥是最致命的，其并發(fā)癥不僅與血糖水平有關(guān)，還與年齡、遺傳和糖尿病病程等因素有關(guān)。除臨床干預(yù)外，科學(xué)合理的運(yùn)動(dòng)也能有效預(yù)防和治療2 型糖尿病，同時(shí)科學(xué)規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能有效降低機(jī)體慢性炎癥，使心血管免受損傷[4]，但其作用機(jī)制尚不清楚。

荔枝中富含多種活性成分，其中荔枝多酚是最重要的活性成分之一，其特殊的鄰二酚結(jié)構(gòu)，使得荔枝多酚具有多種生理功效，如抗氧化[5]、抗炎等作用[6]，并能較好地改善糖尿病大鼠的胰島素抵抗（IR）[7]及糖尿病引起的血管炎癥[8]，但荔枝多酚的抗炎作用機(jī)制尚不清晰。目前還尚未見(jiàn)將有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚聯(lián)合起來(lái)作為一種手段治療2 型糖尿病血管炎癥的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)對(duì)2 型糖尿病大鼠進(jìn)行8 周有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚干預(yù)，評(píng)價(jià)有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚聯(lián)合治療對(duì)2 型糖尿病大鼠血管炎癥的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

ZE5 流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）；SW-CJ-2FB 超凈工作臺(tái)（上海仙象儀器儀表有限公司）；HBS-1096C 酶標(biāo)分析儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FT-PCR 儀（山東風(fēng)途物聯(lián)網(wǎng)科技有限公司）；DYY-7C 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試藥

荔枝多酚（批號(hào)：84650-60-2，上海源葉生物科技有限公司，純度＞98.5%）；活性氧（ROS）試劑盒（批號(hào)：E-BC-K138-F，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；磷酸鹽緩沖液（批號(hào)：20190725，廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：201020101，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號(hào)：20131328）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：20160816）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號(hào)：20190721，武漢谷歌生物有限公司）；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（批號(hào)：20119124，深圳子科生物科技有限公司）；白介素-1β（IL-1β）試劑盒（批號(hào)：20190118，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；白介素-6（IL-6）試劑盒（批號(hào)：20180518，武漢艾迪抗生物科技有限公司）；白介素-10（IL-10）試劑盒（批號(hào)：20200103，武漢菲恩生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號(hào)：20180462，上海哈靈生物科技有限公司）；NFκBp65 一抗（批號(hào)：20191225，武漢賽維爾生物科技有限公司）；IκBα一抗（批號(hào)：20170513，美國(guó)BD 公司）。

1.3 動(dòng)物

6 周齡SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，平均體質(zhì)量（220.8±11.65）g [北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證為：SCXK（京）20160011]。大鼠的基礎(chǔ)飼料和蒸餾水均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。所有實(shí)驗(yàn)研究均符合中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。

2 方法

2.1 造模

選取SD 大鼠60 只，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度和相對(duì)濕度分別在（22±2）℃和55%～75%，接受自然光照，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)選取8 只作為正常組（control group，CG），普通飼料喂養(yǎng)。其余52 只作為糖尿病造模組，采用高脂飼料（66.5%大鼠維持飼料＋10%豬油＋20%蔗糖＋2.5%膽固醇＋1%膽酸鈉）喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4 周后，對(duì)大鼠禁食12 h，高脂飲食大鼠腹腔注射30 mg·kg－1鏈脲佐菌素（STZ），CG 大鼠腹腔注射相同體積的檸檬酸緩沖液，期間觀察各組大鼠的攝食、飲水和排尿變化。在各組大鼠注射STZ后的第3、7 和14日分別測(cè)定其血糖值，當(dāng)大鼠空腹血糖值高于11.1 mmol·L－1時(shí)，說(shuō)明2 型糖尿病大鼠模型造模成功。

2.2 分組

CG 大鼠8 只。將造模成功的2 型糖尿病大鼠隨機(jī)分為4 組：糖尿病對(duì)照組（DCG），糖尿?。\(yùn)動(dòng)干預(yù)組（DEG），糖尿?。笾Χ喾痈深A(yù)組（DLPG），糖尿病＋荔枝多酚＋運(yùn)動(dòng)干預(yù)組（DLPEG），每組10 只，干預(yù)時(shí)間設(shè)定為8 周。

2.3 給藥方式

每日上午9：00 給予DLPG 和DLPEG 的大鼠灌胃500 mg·kg－1荔枝多酚，其他組灌胃等體積的蒸餾水，每周7 d，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每日監(jiān)測(cè)各組大鼠的飲水量。

2.4 運(yùn)動(dòng)方案

DEG 和DLPEG 的大鼠在訓(xùn)練前，先進(jìn)行每日10 min 的適應(yīng)性游泳，共計(jì)5 d，適應(yīng)訓(xùn)練結(jié)束后，DEG 和DLPEG 的大鼠進(jìn)行正式有氧干預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定為1 h·d－1，每周5 d，共8 周，前4周無(wú)負(fù)重游泳，后4 周為1%體質(zhì)量負(fù)荷。游泳池為圓形塑料桶（60 cm 直徑×75 cm 高），水深、水溫分別控制在45～50 cm 和32～35℃，每桶可同時(shí)容納3 只大鼠游泳。在整個(gè)游泳過(guò)程中，監(jiān)控大鼠游泳狀況，防止大鼠溺水淹死。

2.5 樣本制備

當(dāng)大鼠經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8 周后，過(guò)夜禁食，然后采用水合氯醛麻醉大鼠，腹動(dòng)脈取血，血液樣本在4℃、4000 r·min－1離心15 min，取上清液，置于－20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。迅速剝離主動(dòng)脈置于冷凍管中，－80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 指標(biāo)測(cè)定

2.6.1 血糖測(cè)定 采用尾部采血方式，利用血糖儀和血糖試紙測(cè)定各組大鼠禁食12 h 后血糖濃度。

2.6.2 血清樣本檢測(cè) 采用ELISA 檢測(cè)法測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、總膽固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）和胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）及血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1），以上指標(biāo)測(cè)定均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明執(zhí)行。

2.6.3 大鼠血管SOD、GSH-Px、CAT 活性、MDA濃度和ROS 水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)前從－80℃的冰箱中取出主動(dòng)脈，按照1∶9 比例加入生理鹽水、充分研磨，制備成10%組織勻漿液，采用BCA 試劑盒測(cè)定勻漿液中的蛋白濃度，然后按照SOD、GSH-Px、CAT 和MDA 試劑盒測(cè)定SOD、GSH-Px、CAT 活性和MDA 濃度；利用流式細(xì)胞分析儀測(cè)定ROS 水平。

2.6.4 RT-PCR 法檢測(cè)NF-κBp65 和IκBαmRNA 的相對(duì)表達(dá)水平 利用TRIZOL 試劑提取大鼠主動(dòng)脈總RNA。采用紫外-分光光度測(cè)定其OD260nm/OD280nm的比值在1.8～2.0，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以其cDNA 產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR。通過(guò)該方法測(cè)定NF-κBp65 和IκBαmRNA 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。選取GAPDH 作為內(nèi)參，以NF-κBp65 和IκBαmRNA 與GAPDH 的mRNA 表達(dá)含量比值作為該因子相對(duì)表達(dá)水平。反轉(zhuǎn)錄程序如下：95℃保持5 min；94℃保持15 s；55℃保持20 s；72℃保持20 s，40 個(gè)循環(huán)；設(shè)定收集熒光，每個(gè)處理重復(fù)3次。依據(jù)公式（1）計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)水平。

2.6.5 Western blot 法檢測(cè)NF-κBp65 和IκBαmRNA的蛋白相對(duì)表達(dá)水平 采用RIPA 裂解液裂解大鼠主動(dòng)脈，利用BCA 試劑盒測(cè)定總蛋白含量。蛋白測(cè)定后，取20 μL 蛋白樣品上樣于5%～10% SDS-PAGE凝膠，電泳分離，冰浴下將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉25℃搖床封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜。次日換為HRP 標(biāo)記的二抗孵育1 h，采用ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，通過(guò)凝膠成像檢測(cè)NFκBp65、IκBα和GADPH 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果利用Image Lab 軟件對(duì)相應(yīng)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

2.7 數(shù)據(jù)處理

本研究所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Statistix 8.0 軟件對(duì)每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），P＜0.05 代表組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用SAS 8.0 軟件分析結(jié)果，Origin 9.0進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果

3.1 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠糖代謝的影響

DCG、DEG、DLPG 和DLPEG 大鼠中TC 和LDH-C 水平均顯著高于CG 大鼠（P＜0.05），而HDL-C 顯著低于CG 大鼠（P＜0.05），DCG、DEG、DLPG 和DLPEG 大鼠中TC、LDH-C 和HDL-C 水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚干預(yù)不會(huì)影響2 型糖尿病大鼠中TC、LDH-C 和HDL-C 水平。與CG 相比，DCG、DEG、DLPG 和DLPEG 大鼠中FBG 和HOMA-IR 水平均顯著增加（P＜0.05）；與CG 相比，DCG 和DEG 大鼠中FINS 水平顯著增加（P＜0.05），而DLPG 和DLPEG 大鼠中FINS 水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與DCG 相比，DEG、DLPG 和DLPEG 大鼠中FBG和HOMA-IR 水平均顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明單獨(dú)采用有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚干預(yù)及兩者聯(lián)合干預(yù)均能改善FBG 和HOMA-IR 水平。DCG 大鼠FINS 水平顯著高于其他組（P＜0.05），DEG 大鼠FINS 水平顯著高于CG、DLPG 和DLPEG（P＜0.05）。CG、DLPG 和DLPEG 大鼠中FINS 水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）（見(jiàn)表1）。綜上說(shuō)明3 種干預(yù)措施均能改善大鼠FBG 和HOMA-IR 水平，且有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚聯(lián)合效果更好。

表1 大鼠糖脂代謝指標(biāo)Tab 1 Indicators of glucose and lipid metabolism in rats

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血清炎癥標(biāo)志物的影響

采用有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)8周后，與CG 相比，DCG 大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）水平均顯著升高（P＜0.05），結(jié)果表明糖尿病能促進(jìn)炎癥的形成。單獨(dú)采用有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)2 型糖尿病大鼠，大鼠血清中IL-1β、IL-6 和MCP-1 水平與DCG 相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），而VCAM-1 和TNF-α水平顯著低于DCG 大鼠（P＜0.05）。采用有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)2 型糖尿病大鼠，大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 和VCAM-1 水平均顯著低于DCG 和其他干預(yù)組，然而IL-10 水平與上述5 個(gè)指標(biāo)變化有相反的趨勢(shì)，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚、有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)2 型糖尿病大鼠均能有效降低大鼠血清促炎癥因子的水平及MCP-1 和VCAM-1 水平，增加抑制炎癥因子的產(chǎn)生，同時(shí)有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚具有協(xié)同效應(yīng)，共同抑制2 型糖尿病大鼠血清炎癥因子的釋放，促進(jìn)促炎癥因子的釋放，從而達(dá)到治療血管炎癥的目的。

圖1 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血清炎癥標(biāo)志物的影響Fig 1 Effect of aerobic exercises and litchi polyphenols on the serum inflammation markers in type 2 diabetic rats

3.3 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)大鼠血管抗氧化酶活性及MDA 濃度的影響

DCG 大鼠血管中SOD、GSH-Px 和CAT 活性顯著低于CG（P＜0.05），而MDA 濃度顯著高于CG（P＜0.05），具體見(jiàn)圖2，表明2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)抗氧化酶活性降低和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增加，易受外界刺激而造成機(jī)體應(yīng)激性損傷。采用有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚分別干預(yù)2 型糖尿病大鼠，血管內(nèi)SOD、GSH-Px 和CAT 活性顯著高于DCG（P＜0.05），而MDA 濃度顯著低于DCG（P＜0.05），且干預(yù)效果為有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚＞荔枝多酚＞有氧運(yùn)動(dòng)，具體見(jiàn)圖2。結(jié)果表明有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚均能提高2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)來(lái)降低血管氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而抑制炎癥相關(guān)通路的激活，達(dá)到治療血管炎癥的目的。

圖2 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)大鼠血管抗氧化酶活性及MDA 濃度的影響Fig 2 Effect of aerobic exercises and litchi polyphenols on the antioxidant enzyme activity and MDA concentration in rats

3.4 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)ROS 水平的影響

機(jī)體在正常生理狀態(tài)下，ROS 的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，適量的ROS 能提高巨噬細(xì)胞吞噬能力和機(jī)體免疫力[9]。但當(dāng)機(jī)體受到外界氧化應(yīng)激原刺激時(shí)，引起血管內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，而過(guò)量的ROS 對(duì)細(xì)胞膜、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 造成氧化損傷[10]。本研究以DCFH-DA 作為熒光探針，在流式細(xì)胞分析儀上檢測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚對(duì)大鼠血管內(nèi)ROS 水平的影響，其平均熒光強(qiáng)度大小直觀反映血管內(nèi)ROS 水平。DCG 大鼠血管內(nèi)ROS 水平顯著高于CG（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)圖3，說(shuō)明糖尿病大鼠體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，易造成機(jī)體應(yīng)激性損傷。與DCG 相比，DEG、DLPG 和DLPEG 中大鼠血管內(nèi)ROS 水平顯著降低（P＜0.05），結(jié)果表明有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)均能顯著降低大鼠血管內(nèi)ROS 水平，來(lái)抵御外界氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管炎癥。

圖3 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)ROS 水平的影響Fig 3 Effect of aerobic exercises and litchi polyphenols on the level of ROS in blood vessels of type 2 diabetic rats

3.5 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)NF-κBp65 和IκBα mRNA 表達(dá)水平的影響

在正常生理?xiàng)l件下，抑制劑IκB 與NF-κBp65以失活狀態(tài)結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)機(jī)體受到外界應(yīng)激刺激時(shí)，IκB 被降解，使抑制劑IκB 與NF-κBp65分離，隨之轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，激活細(xì)胞內(nèi)的炎癥相關(guān)基因[11]。本研究通過(guò)RT-PCR 測(cè)定NF-κBp65 和IκBαmRNA 表達(dá)水平來(lái)判斷NF-κB 信號(hào)的激活狀態(tài)。DCG 大鼠血管內(nèi)NF-κBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平顯著高于CG（P＜0.05），而IκBαmRNA 表達(dá)水平顯著低于CG（P＜0.05），說(shuō)明2 型糖尿病大鼠使IκB 與NF-κBp65 解體，進(jìn)而激活炎癥相關(guān)的基因（見(jiàn)圖4）。采用有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)均能顯著降低2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)NF-κBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)，而增加IκBαmRNA 表達(dá)水平（P＜0.05），進(jìn)而抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，且有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)效果明顯優(yōu)于單純的有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚干預(yù)。

圖4 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)NF-κBp65和IκBα mRNA 表達(dá)水平的影響Fig 4 Effect of aerobic exercises and litchi polyphenols on the expression of NF-κBp65 and IκBα mRNA in type 2 diabetic rats

3.6 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)NF-κBp65 和IκBα 蛋白表達(dá)水平的影響

與CG 相比，DCG 大鼠血管內(nèi)NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平水平顯著提高（P＜0.05），而IκBα蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），具體見(jiàn)圖5。DEG、DLPG 和DLPEG 中NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平較DCG 大鼠顯著降低（P＜0.05），IκBα蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果表明有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)均可以抑制NF-κB 信號(hào)的激活，從而達(dá)到抑制炎癥的發(fā)生，且有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)效果明顯優(yōu)于單純的有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚干預(yù)。

圖5 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)NF-κBp65 和IκBα 蛋白表達(dá)水平的影響Fig 5 Effect of aerobic exercises and litchi polyphenols on the expression of NF-κBp65 and IκBα protein in the blood vessels of type 2 diabetic rats

4 討論

4.1 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響

胰島素抵抗、高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂等多種因素均可誘導(dǎo)血管炎癥的發(fā)生。本研究表明有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚聯(lián)合治療均能改善2 型糖尿病大鼠血糖，有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚聯(lián)合治療在胰島素抵抗指數(shù)方面優(yōu)于有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚。其原因是荔枝多酚通過(guò)降低肝臟糖異生作用，抑制腸系膜細(xì)胞吸收，維持血糖平衡[12]。此外，運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)促進(jìn)骨骼肌對(duì)血糖的吸收和利用，從而達(dá)到降糖作用[13]。進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚聯(lián)合治療在改善2型糖尿病大鼠血糖方面要優(yōu)于有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚，表明荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)在改善2 型糖尿病大鼠血糖方面具有協(xié)同作用。運(yùn)動(dòng)能夠通過(guò)影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗的發(fā)生，改善胰島素敏感性，荔枝多酚可通過(guò)激活骨骼肌AMPK 信號(hào)來(lái)增加外周胰島素敏感性，抑制炎癥相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)[14]。綜上，有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚可能部分通過(guò)降低血糖和胰島素抵抗改善糖尿病大鼠血管炎癥。

4.2 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血管炎癥相關(guān)因子的影響

隨著人們生活水平的提高，高脂飲食越來(lái)越常見(jiàn)，長(zhǎng)期的高脂飲食會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而激活炎癥相關(guān)的通路，導(dǎo)致血管發(fā)生炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病[15]。大量研究證實(shí)血液中炎癥因子濃度高低可反應(yīng)血管的炎癥狀態(tài)[16]。本研究選取了促炎因子、抗炎因子、細(xì)胞黏附分子和趨化因子4 種類型細(xì)胞因子以及主動(dòng)脈細(xì)胞黏附分子基因和蛋白表達(dá)反映血管炎癥。TNF-α是一種多功能的細(xì)胞因子，在炎癥的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其可激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子的合成與釋放[17]。IL-6 由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，參與絕大多數(shù)由炎癥引起的急性期蛋白的調(diào)節(jié)[18]；IL-1β在炎癥初期大量產(chǎn)生，在各種炎癥疾病患者體內(nèi)大量存在[19]；IL-10 屬于抗炎因子，由免疫和非免疫細(xì)胞分泌而來(lái)，主要抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放[20]。內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌所產(chǎn)生的MCP-1 可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向血管炎癥部位遷移，導(dǎo)致炎癥發(fā)生[21]。VCAM-1能特性表達(dá)于血管組織，能有效促進(jìn)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，在血管炎癥反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[22]。近年來(lái)研究表明多酚具有顯著的降糖活性和抗炎活性[23-24]。本研究結(jié)果表明荔枝多酚能顯著降低2 型糖尿病大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 和VCAM-1 水平，同時(shí)顯著增加抗炎因子IL-10 水平，說(shuō)明荔枝多酚具有降低2 型糖尿病大鼠炎癥的作用；采用有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)2 型糖尿病大鼠也有類似的結(jié)果，表明有氧運(yùn)動(dòng)可在一定程度上抑制2 型糖尿病大鼠炎癥的發(fā)生；采用荔枝多酚＋有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合干預(yù)2 型糖尿病大鼠，抗炎效果明顯優(yōu)于單純的有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚干預(yù)。

4.3 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激的影響

在糖尿病狀態(tài)下，機(jī)體糖脂代謝發(fā)生紊亂，氧化應(yīng)激信號(hào)通路被激活，使得細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性，最終誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[25]。此外，還可以通過(guò)激活NF-κB 炎癥信號(hào)，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。氧化應(yīng)激能誘發(fā)糖尿病的發(fā)病，同時(shí)也能導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。因此，有效抑制機(jī)體氧化應(yīng)激的發(fā)生，可以減輕因其導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷，同時(shí)在一定程度上抑制炎癥的發(fā)生。機(jī)體防御氧化應(yīng)激損傷體系中總抗氧化能力的主要作用是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的ROS 動(dòng)態(tài)平衡。GSH-Px、SOD和CAT 是細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的重要組成部分。在抵御外界氧化應(yīng)激刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的SOD 和CAT 首先發(fā)揮抗氧化功能[26]。GSH-Px 在機(jī)體內(nèi)作為一種重要的過(guò)氧化物分解酶，催化過(guò)氧化物和GSH還原成無(wú)毒的羥基化合物和谷胱甘肽，從而有效抑制過(guò)氧化物的損傷[27]。因此，機(jī)體抗氧化物酶系在發(fā)揮機(jī)體抗氧化和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)平衡中起到至關(guān)重要的作用，抗氧化酶活力的高低直接反映出機(jī)體對(duì)外界氧化應(yīng)激造成損傷的調(diào)控能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各單獨(dú)干預(yù)組2 型糖尿病大鼠血管內(nèi)GSH-Px、SOD 和CAT 的活性均顯著提高，而ROS 水平顯著降低，且有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚聯(lián)合治療效果優(yōu)于單獨(dú)治療，推測(cè)可能是通過(guò)降低氧化應(yīng)激緩解糖尿病大鼠血管炎癥。

4.4 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚對(duì)2 型糖尿病大鼠主動(dòng)脈NF-κB 信號(hào)通路的影響

NF-κB 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是炎癥發(fā)生和發(fā)展中最為重要的信號(hào)通路。NF-κB 信號(hào)通路參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)促炎基因的表達(dá)。在生理狀態(tài)下，抑制劑IκB 與NF-κB 亞基p65 以失活狀態(tài)緊密結(jié)合，并存于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到外界氧化應(yīng)激刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)IKK 信號(hào)被激活，使IκB 發(fā)生磷酸化，并被蛋白酶降解，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB 亞基p65脫離IκB，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，進(jìn)而激活下游的靶基因（TNF-α、VCAM-1、MCP-1和IL-1β）等的表達(dá)[28]。高糖和脂質(zhì)代謝紊亂均能激活血管內(nèi)皮NF-κB 信號(hào)通路，并增加局部炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[29]。本研究結(jié)果表明2 型糖尿病大鼠主動(dòng)脈NF-κBp65 基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組，但僅僅通過(guò)NF-κBp65 基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平還不能判斷該炎癥信號(hào)通路被激活。因此，本研究又對(duì)抑制劑IκBα進(jìn)行基因和蛋白的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)DCG 大鼠主動(dòng)脈中的IκBα基因和蛋白表達(dá)水平均顯著低于CG，表明2 型糖尿病大鼠主動(dòng)脈中抑制劑IκB 與NF-κB 亞基p65 基因已經(jīng)分離，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。同時(shí)2 型糖尿病大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 和VCAM-1水平均顯著高于CG，而IL-10 顯著低于CG，上述這些相關(guān)基因又受到NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控，推測(cè)糖尿病可能通過(guò)激活NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)下游炎癥因子的表達(dá)，而IL-1β和TNF-α的增加，可進(jìn)一步激活NF-κB 信號(hào)通路，上述過(guò)程不斷循環(huán)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇。各干預(yù)措施均能顯著下調(diào)NF-κBp65 基因和蛋白表達(dá)水平，并顯著上調(diào)IκBα基因和蛋白表達(dá)，有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)效果明顯優(yōu)于單純有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚，且大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 和VCAM-1水平顯著低于DCG。結(jié)果表明有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)均可能通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)來(lái)減輕血管炎癥。

5 結(jié)論

有氧運(yùn)動(dòng)、荔枝多酚和有氧運(yùn)動(dòng)＋荔枝多酚干預(yù)均能降低2 型糖尿病大鼠血管炎癥，其中聯(lián)合干預(yù)措施大鼠FBG、HOMA-IR、IL-1β、IL-6、VCAM-1、MCP-1、TNF-α、MDA、ROS 和NFκBp65 基因/蛋白表達(dá)水平均顯著低于單純的有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚干預(yù)，而GSH-Px、SOD 和CAT活性均顯著高于單純的有氧運(yùn)動(dòng)和荔枝多酚干預(yù)。有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合荔枝多酚可能通過(guò)改善2 型糖尿病大鼠血糖代謝、降低血管氧化應(yīng)激、抑制NF-κB信號(hào)來(lái)緩解2 型糖尿病大鼠的血管炎癥。