黃燕，陳宇，米榮升，左佳坤，王志豪，韓先干，劉永杰，陳兆國(guó)*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/動(dòng)物健康與食品安全國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 200241)

伴隨規(guī)模化養(yǎng)雞業(yè)的蓬勃發(fā)展，集約化養(yǎng)殖造成寄生蟲、細(xì)菌和病毒等感染的狀況日益嚴(yán)重，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。貝氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumbaileyi，C.baileyi)是感染雞的優(yōu)勢(shì)蟲種，主要侵犯呼吸道、法氏囊、腸道和泄殖腔等部位[1-2]。有報(bào)道稱雛雞感染貝氏隱孢子蟲后造成新城疫疫苗和禽流感疫苗的接種失敗[3]。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病病原之一[4]，有非常高的傳染率和死亡率。這兩種病原體常常共同感染雞群，與禽類的“腸毒綜合征”[5]密切相關(guān)。

胃腸道微生物群落(microbial community in gastrointestinal tract)對(duì)動(dòng)物健康起重要作用。眾多研究報(bào)道，腸道菌群在營(yíng)養(yǎng)吸收、飼料消化和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-10]。近年來(lái)，對(duì)腸道寄生蟲與菌群相互作用研究發(fā)現(xiàn)，原蟲或蠕蟲感染均可導(dǎo)致腸道微生物組成和多樣性的改變，對(duì)宿主的具體致病作用和影響則與蟲種有關(guān)[11]。此外，部分腸道菌群也影響致病菌對(duì)機(jī)體的感染與危害。對(duì)腸道菌群的綜合分析可以更好地了解致病微生物之間的互作和多樣性，而目前關(guān)于貝氏隱孢子蟲單獨(dú)以及合并感染大腸桿菌后宿主腸道菌群的變化還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究通過(guò)16S rRNA測(cè)序技術(shù)，探究貝氏隱孢子蟲單獨(dú)以及合并感染大腸桿菌后雛雞糞樣中菌群的變化，為后續(xù)相關(guān)致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株和菌株

C.baileyi自雞體內(nèi)分離，并由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室傳代保存。大腸桿菌DE17為APEC的臨床分離株，來(lái)源于2008年安徽省的患病鴨[12]，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所韓先干研究員饋贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康SPF級(jí)1日齡巴布考克雄性雛雞30只，購(gòu)自浙江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司(動(dòng)物合格證編號(hào)為L(zhǎng)HNY20190514)，試驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物的處理符合動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。將30只1日齡SPF雛雞隨機(jī)分為3組，分別為貝氏隱孢子蟲單獨(dú)感染組(A)、貝氏隱孢子蟲和大腸桿菌混合感染組(B)和健康對(duì)照組(N)，每組10只。

1.3 接種和樣本采集

各組SPF級(jí)1日齡巴布考克雄性雛雞適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，A組雛雞灌胃接種貝氏隱孢子蟲1×106個(gè)/只；B組肌肉注射大腸桿菌DE17 2×106CFU/只，同時(shí)灌胃接種貝氏隱孢子蟲 1×106個(gè)/只；N組為健康對(duì)照組。于接種后第3、9、15、21和27天采集3組新鮮糞便，放到標(biāo)記后的5 mL糞樣采集盒中，-80 ℃冰箱保存待用。

1.4 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

使用土壤DNA提取試劑盒(MP，USA)提取樣本基因組DNA，利用紫外分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。取適量的樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣本至20 ng/μL。所有提取的基因組DNA存放于-20 ℃保存。

以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇細(xì)菌16S rRNA V3-V4測(cè)序區(qū)域，使用帶Barcode的特異引物，正向引物為343F (5 ′- TACGGRAGGCAGCAG -3 ′)，反向引物為798R (5 ′- AGGGTATCTAATCCT -3 ′)。2×Gflex PCR Buffer 15 μL、Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 0.6 μL、Primer F(5 pmol/μL) 1 μL、Primer R(5 pmol/μL) 1 μL、樣本DNA模板2.5 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足，組成30 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：94 ℃初始變性5 min； 94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s， 26個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，并保持在4 ℃。每份樣本進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠提取試劑盒(AXYGEN，USA)回收目的片段。

1.5 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

利用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit (Invitrogen，USA)和Q-PCR對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行鑒定。用NaOH將序列變性為單鏈后進(jìn)行測(cè)序。采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)和相應(yīng)的MiSeq Reagent Kit V3進(jìn)行測(cè)序。使用Trimmomatic軟件對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜，利用FLASH軟件得到清潔數(shù)據(jù)(clean tags)，每組數(shù)據(jù)量分布在38 014～41 971條之間。使用UCHIME軟件進(jìn)行嵌合體過(guò)濾，每組得到的數(shù)據(jù)量分布在23 508～37 135條之間，平均長(zhǎng)度為431.72～439.52 bp范圍內(nèi)的有效數(shù)據(jù)(valid tags)，可用于后續(xù)分析(表1)。

表1 各組樣品菌群測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控比較

1.6 生物信息學(xué)分析

將所有樣品的有效數(shù)據(jù)采用Vsearch軟件，以97%的相似性將序列聚類成為運(yùn)算分類單位 (operational taxonomic units，OTUs)，再利用QIIME軟件挑選出各個(gè)OTUs的代表序列，使用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)和RDP classifier軟件對(duì)所有代表序列進(jìn)行比對(duì)和注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。對(duì)OTUs進(jìn)行豐度分析，利用Biology diversity Pro軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析(Chao1、Shannon和Simpson指數(shù))，用以得到各組共有和特有的OTUs信息，進(jìn)行PCoA分析。根據(jù)OTUs的物種注釋結(jié)果，選取樣品所在門(Phylum)和屬(Genus)上豐度排名前15的物種，生成物種相對(duì)豐度圖，觀察各組樣品在門和屬水平上的差別。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTUs聚類分析

對(duì)valid tags進(jìn)行OTUs分類，各樣本OTUs個(gè)數(shù)分布在109～328之間；樣品差異統(tǒng)計(jì)顯示，差異OTUs個(gè)數(shù)為170個(gè)，其中門差異個(gè)數(shù)為4個(gè)，屬差異個(gè)數(shù)為60個(gè)。各組OTUs數(shù)量差異，B組在感染后第3～15天均低于健康對(duì)照組(N組)，且第3和9天差異極顯著(P<0.01)，而第15天差異顯著(P<0.05)(圖1)。

與N組比較，**表示P<0.01，*表示P<0.05。下同

2.2 物種豐度聚類分析

聚類分析結(jié)果顯示(圖2)，相對(duì)豐度最高的門是厚壁菌門(Firmicutes)，除B組在感染第3天和第9天時(shí)的相對(duì)豐度分別為52.2%和59%之外，其他組均無(wú)顯著差異(P>0.05)。B組相對(duì)豐度排名第二的是變形菌門(Proteobacteria)，第三為擬桿菌門(Bacteroidetes)；N組和A組排名第二的為擬桿菌門，第三為變形菌門。對(duì)于變形菌門，與N組相比，B組在感染后第3、第9天相對(duì)豐度極顯著增加(P<0.001)；第15天后相對(duì)豐度開(kāi)始下降，直至第27天各組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。對(duì)于擬桿菌門，B組結(jié)果剛好與變形菌門相反，前期相對(duì)豐度極顯著低于其他組(P<0.001)；到第15天后相對(duì)豐度逐步上升，縮短與其他2組的差距。

圖2 門水平不同組的物種譜

選取相對(duì)豐度排名前15的屬，其中9個(gè)屬于厚壁菌門，4個(gè)屬于變形菌門和2個(gè)屬于擬桿菌門(圖3A)；同時(shí)，選取在雞中常見(jiàn)的4個(gè)屬進(jìn)行具體分析，即乳桿菌屬(Lactobacillus)、大腸/志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和布勞特氏菌屬(Blautia)。為更詳細(xì)了解各組屬之間的變化，使用相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度同時(shí)作圖。如圖3A所示，排名前兩位的分別是隸屬于厚壁菌門的乳桿菌屬和隸屬于變形菌門的大腸/志賀菌屬，B組在感染前期(第3和第9天)的乳桿菌屬豐度顯著低于N組，而大腸/志賀菌屬則高于N組；隨后，乳桿菌屬和大腸/志賀菌屬一直處于此消彼長(zhǎng)的狀態(tài)，即在乳桿菌屬絕對(duì)豐度高時(shí)大腸/志賀菌屬則低，直至第27天這種情況才趨于穩(wěn)定(圖3B和圖3C)。排在第11位的瘤胃球菌屬和第18位的布勞特氏菌屬的絕對(duì)豐度整體呈上升趨勢(shì)，不同的是2個(gè)感染組的瘤胃球菌屬絕對(duì)豐度只有在第9天顯著低于健康對(duì)照組(圖3D)；而布勞特氏菌屬中，相較于健康對(duì)照組，2個(gè)感染組的上升趨勢(shì)較緩慢，且絕對(duì)豐度顯著低于健康對(duì)照組，尤其是共感染組(圖3E)。

A.屬水平的相對(duì)豐度；B.乳桿菌屬；C.大腸/志賀菌屬；D.瘤胃球菌屬；E.布勞特氏菌屬。與N組比較，***表示P<0.001

2.3 腸道菌群多樣性分析

表2顯示，Chao1指數(shù)伴隨時(shí)間整體呈上升趨勢(shì)；同一時(shí)間，N組與A組和B組樣品之間的Chao1指數(shù)存在顯著差異(P<0.05)。表3顯示，N組Shannon指數(shù)數(shù)值逐漸增大，且存在顯著差異(P<0.05)；A組和B組Shannon指數(shù)數(shù)值伴隨時(shí)間整體上升，但其間存在反復(fù)，且差異顯著(P<0.05)；在同一時(shí)間，與N組比，A組和B組群落多樣性豐富度降低，且除第27天，B組與N組之間存在顯著差異(P<0.05)。表4顯示，各組群落多樣性呈豐富趨勢(shì)，且各組差異顯著(P<0.05)；同一天各組之間差異顯著，第3天A組和B組與N組差異顯著(P<0.05)，第9、15和21天B組與N組差異顯著(P<0.05)，直至第27天各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 不同組菌群多樣性Chao1指數(shù)比較

表3 不同組菌群多樣性Shannon指數(shù)比較

表4 不同組菌群多樣性Simpson指數(shù)比較

3 討論

機(jī)體腸道微生態(tài)環(huán)境處于動(dòng)態(tài)平衡才能維持正常的腸道功能。已有研究表明，腸道菌群的失衡與宿主疾病和致病微生物(細(xì)菌或寄生蟲)的感染等因素有關(guān)[11，13]。盡管已有許多研究調(diào)查在不同情況下家禽腸道菌群的組成和變化，但是通常是研究禽類回腸和盲腸中的菌群變化，很少使用糞便中菌群變化評(píng)估腸道致病菌或寄生蟲產(chǎn)生的影響。根據(jù)先前的研究，整合16S rRNA V3-V4區(qū)域可能會(huì)為微生物多樣性和OTUs分類提供更好的分辨率[14-15]。因此，本研究采用16S rRNA V3-V4區(qū)域高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)分析對(duì)貝氏隱孢子蟲單獨(dú)以及合并感染大腸桿菌后雛雞糞便樣品中腸道菌群的變化，評(píng)估其危害性。

本研究3組雛雞腸道菌群屬的數(shù)量伴隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，這與隨雛雞年齡增長(zhǎng)，其腸道微生物數(shù)量變得更加復(fù)雜相符[16-17]。多樣性和豐富度是反映腸道菌群組成的重要指標(biāo)之一。Chao1指數(shù)是用來(lái)反映微生物豐富度的指標(biāo)，與豐度、均勻度無(wú)關(guān)，對(duì)稀有的微生物很敏感，即數(shù)值越大則物種越豐富；Shannon指數(shù)彌補(bǔ)Chao1指數(shù)的不足，綜合考慮群落的豐富度和均勻度用以評(píng)估微生物多樣性，數(shù)值越大，群落多樣性越高；Simpson指數(shù)同樣是用來(lái)估算樣品中微生物多樣性的指標(biāo)之一，不過(guò)其數(shù)值意義與Shannon指數(shù)相反，數(shù)值越大說(shuō)明群落多樣性越低。可從Chao1、Shannon和Simpson等指數(shù)結(jié)果中觀察得到，本研究3組雛雞腸道菌群的豐富度和多樣性伴隨時(shí)間呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，此結(jié)果與動(dòng)物腸道的成分在成長(zhǎng)過(guò)程中從簡(jiǎn)單變?yōu)閺?fù)雜相一致[18]。其中，貝氏隱孢子蟲單獨(dú)感染與貝氏隱孢子蟲和大腸桿菌共感染皆造成腸道菌群多樣性降低，但貝氏隱孢子蟲單獨(dú)感染組的腸道菌群多樣性比共感染組先恢復(fù)，推測(cè)可能因?yàn)榇竽c桿菌的共感染加劇了貝氏隱孢子蟲感染引起的變化，造成其腸道菌群恢復(fù)減緩。有研究發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染能夠?qū)е蚂`長(zhǎng)類動(dòng)物腸道微生物多樣性降低[19]，而犢牛感染大腸桿菌O1后腸道菌群的豐度和多樣性發(fā)生降低[20]，這些研究與本文結(jié)果一致。

本研究選取豐度排名前15的屬對(duì)3組樣本在屬和所屬的門水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3組樣本中不同菌屬的表達(dá)豐度不完全一致，說(shuō)明單獨(dú)感染貝氏隱孢子蟲或混合感染大腸桿菌的雛雞腸道菌群存在差異。3組糞樣樣本腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門中最主要的是厚壁菌門，此結(jié)果與以往的研究結(jié)果相一致，厚壁菌門在雞的各個(gè)年齡段中皆為最主要的優(yōu)勢(shì)菌門，占總數(shù)的70%以上[21-23]；其次為變形菌門和擬桿菌門，但是二者的豐度高低在3組樣本中存在差異，共感染組變形菌門的相對(duì)豐度在感染后第3和第9天顯著比其他2組高，該門包含許多致病菌，如大腸桿菌、沙門菌和霍亂弧菌等。在賈第蟲感染模型中發(fā)現(xiàn)，賈第蟲定植可導(dǎo)致需氧和厭氧菌失調(diào)，表現(xiàn)為需氧菌變形菌門增多，厭氧菌厚壁菌門減少[24]。由于共感染組在感染貝氏隱孢子蟲的同時(shí)還感染了大腸桿菌，造成腸道微生物嚴(yán)重失衡，有害菌群急劇增多；伴隨炎癥的好轉(zhuǎn)，變形桿菌的比例逐漸回落到與其他組相同的相對(duì)豐度，而擬桿菌門的相對(duì)豐度則回升到第二位。

乳桿菌屬是動(dòng)物腸道中重要的益生菌，可使腸道微生物體系發(fā)生有益的改變，可以抑制腸道內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生[25-26]。本研究中，共感染組在感染后第3、第9天相較其他組乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著降低，但在第15天開(kāi)始相對(duì)豐度逐漸與其他2組相近。Yu等[18]在研究雛雞生長(zhǎng)過(guò)程中盲腸的菌群變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬和費(fèi)氏桿菌屬占細(xì)菌總數(shù)的一半以上，擔(dān)任益生菌的角色。本研究中后期感染組乳桿菌屬豐度恢復(fù)，表明雛雞正在逐步恢復(fù)健康。

大腸/志賀菌屬是最為常見(jiàn)的腸道病原菌，共感染組相比其他2組相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度皆顯著上升，可能與接種大腸桿菌有關(guān)。單獨(dú)感染貝氏隱孢子蟲組與健康對(duì)照組無(wú)明顯差異，表明貝氏隱孢子蟲的感染并無(wú)益于大腸/志賀菌屬細(xì)菌的增長(zhǎng)。此結(jié)果與共感染組變形菌門豐度增高(第二位)相符。

瘤胃球菌屬和布勞特菌屬通常伴隨雛雞年齡的增長(zhǎng)而增加[18]，這與本研究得到的結(jié)果一致。瘤胃球菌屬的增加可能會(huì)增強(qiáng)雛雞對(duì)炎癥的免疫力[18]；布勞特菌屬可以發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)，SCFAs是一種具有脂肪族末端羧酸的有機(jī)酸，是腸黏膜細(xì)胞的能量來(lái)源，在葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝和胰島素敏感性中均有調(diào)節(jié)作用[27-29]。此外，有研究報(bào)道指出SCFAs還可通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體41和43結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1, GLP-1)和酪酪肽(peptide YY, PYY)等的分泌，影響胃液分泌和胃腸蠕動(dòng)[30]。2個(gè)感染組中布勞特菌屬和瘤胃球菌屬盡管伴隨雛雞日齡增長(zhǎng)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但相比健康對(duì)照組絕對(duì)豐度較低，說(shuō)明雛雞感染貝氏隱孢子蟲和大腸桿菌后對(duì)雛雞的采食量、免疫力和代謝功能造成影響。

綜上所述，單獨(dú)感染貝氏隱孢子蟲會(huì)造成腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，而感染貝氏隱孢子蟲的同時(shí)再感染大腸桿菌則加劇此變化，尤其是造成腸道有害菌的豐度增加，益生菌的豐度降低；伴隨雛雞感染時(shí)間延長(zhǎng)，感染組的腸道菌群逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)，但腸道菌群紊亂對(duì)雛雞采食量、免疫力和代謝功能的影響已然發(fā)生。