陳芙，袁婷，郝華芳，儲(chǔ)岳峰，顏新敏*，王鵬雁

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046;2. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832001)

羊支原體肺炎(Mycoplasma pneumonia of sheep and goats,MPSG)在我國(guó)長(zhǎng)期普遍流行，危害巨大。MPSG病原復(fù)雜，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)MPSG的病原至少包括：山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae, Mccp)、綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)和絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)等[1-3]。這3種病原引起的疾病臨床表現(xiàn)以肺炎、胸膜炎等呼吸系統(tǒng)癥狀為主，但文獻(xiàn)報(bào)道Mmc還可導(dǎo)致乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜炎和敗血癥等綜合征(MAKePS)，是傳染性無(wú)乳癥(contagious agalactia, CA)的病原之一[4-6]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)由Mccp和Mo引起的羊支原體肺炎進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，已通過(guò)構(gòu)建人工感染模型等工作研發(fā)了相應(yīng)的疫苗和診斷試劑，并實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化[7-8]。但目前對(duì)Mmc感染的防控技術(shù)研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的不多[9-11]。建立有效的動(dòng)物模型是深入了解病原致病機(jī)制和研發(fā)疫苗等防控技術(shù)的基礎(chǔ)。本文采用Mmc國(guó)內(nèi)分離株對(duì)山羊進(jìn)行人工感染試驗(yàn)觀察，初步了解Mmc感染后山羊的臨床表現(xiàn)和病理特征，為下一步建立Mmc人工感染模型和我國(guó)MPSG病原學(xué)研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

絲狀支原體山羊亞種Mm1901株，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

來(lái)自甘肅榆中某羊場(chǎng)的6月齡左右、體重12 kg中衛(wèi)白山羊6只，隨機(jī)平均分為2組，攻毒組和對(duì)照組。熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)鼻拭子樣品中Mmc核酸[12]，間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)Mmc抗體[13]皆為陰性。

1.3 試驗(yàn)試劑

MTB和MTA培養(yǎng)基，參考文獻(xiàn)[1]制備。PremixTaq和DNA Marker DL2000，購(gòu)自大連寶生物有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒和組織DNA提取試劑盒(離心柱型)，購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 攻毒菌液準(zhǔn)備

用MTB培養(yǎng)基按照1∶10比例接種復(fù)蘇Mm1901株F2代凍存菌液，經(jīng)傳代2次擴(kuò)大培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃后8 000 r/min離心15 min進(jìn)行10倍濃縮，將離心菌體與10 mL上清液混合濃縮后作為攻毒菌液。同時(shí)測(cè)定菌液的菌落形成單位(CFU)(結(jié)果為1.0×109CFU/mL)，并接種血平皿做無(wú)菌檢測(cè)(應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng))。

1.4.2 人工感染

人工感染程序參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行：第1天鼻腔噴霧攻毒2 mL/只，每個(gè)鼻孔各1 mL；第2天同樣噴霧感染；第5天氣管注射6 mL/只。對(duì)照組噴鼻和注射同樣體積的生理鹽水[8-10]。

從第0天開(kāi)始，每天測(cè)量體溫，記錄臨床表現(xiàn)，攻毒前后、剖檢前取全血測(cè)定血常規(guī)。

死亡(鼻腔攻毒后第8天，攻毒程序結(jié)束后第3天)和瀕臨死亡羊剖檢并記錄病變，同時(shí)取肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、氣管等組織樣品進(jìn)行支原體病原學(xué)檢測(cè)，并送成都里來(lái)生物科技有限公司做病理觀察。

1.4.3 Mmc病原學(xué)檢測(cè)

1.4.3.1 引物及反應(yīng)體系、程序

根據(jù)文獻(xiàn)[12]合成引物(見(jiàn)表1)，并按照已公布的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行。反應(yīng)體系：SYBR PremixExTaqⅡ(2×) 12.5 μL，Mmc-1700F 0.5 μL，Mmc-1770R 0.5 μL，模板2 μL，水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 引物信息

1.4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將復(fù)蘇的菌液提取DNA，測(cè)定濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，調(diào)整濃度為1.0×109拷貝數(shù)/μL后進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?.0×108～1.0×102拷貝數(shù)/μL共7個(gè)濃度梯度樣品，作為模板按反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，以各梯度起始模板濃度之對(duì)數(shù)值為x軸，以反應(yīng)之Ct值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3.3 樣品檢測(cè)

將剖檢獲取的各組織樣品組織研磨，試劑盒提取DNA，同時(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)陽(yáng)性培養(yǎng)物提取DNA，同時(shí)利用合成的引物進(jìn)行qPCR定量檢測(cè)組織。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Graphpad Prism 5軟件，對(duì)血常規(guī)參數(shù)進(jìn)行雙因素方差分析(Two-way ANOVA) 。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

山羊鼻腔接種培養(yǎng)物后無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，但氣管攻毒后第2 天體溫明顯上升，最高可達(dá)41.2 ℃，并出現(xiàn)精神沉郁、食欲廢絕、精神異常(臥地或呆立)、頭頸僵直、背腰拱起、腹肋緊縮、咳嗽、口鼻流涎、呼吸極度困難(張口呼吸)、顫動(dòng)，胸部按壓有痛感等臨床癥狀。其中1只羊在氣管攻毒后第3天(噴鼻后第8 天)死亡，其余2只羊?yàn)l死，同時(shí)處死、剖檢。

2.2 剖檢變化

全部攻毒羊頸部皮下水腫嚴(yán)重(下頜至胸前)，氣管上有出血點(diǎn)，呼吸道內(nèi)含有泡沫樣物質(zhì)，氣管被膠凍樣滲出物包裹。肺淤血、出血，大部分肺組織紅色肉變，縱膈、肺門(mén)淋巴結(jié)淤血。腎臟表面、皮質(zhì)有淤血和出血點(diǎn)。脾臟有淤血、梗死灶。心臟水腫有心包積液，透明無(wú)色，左心耳淤血。瘤胃鼓氣，瓣胃、真胃無(wú)食。

2.3 血液參數(shù)變化

使用Graphpad Prism 5軟件對(duì)攻毒組與對(duì)照組山羊在攻毒前后時(shí)間點(diǎn)的組間及組內(nèi)進(jìn)行血液參數(shù)分析，其中對(duì)照組在第0天和第8天均無(wú)差異性(P>0.05)。攻毒組第0天白細(xì)胞總數(shù)(圖1a，P<0.05)、中間細(xì)胞比率(圖1b，P<0.01)、紅細(xì)胞總數(shù)(圖1c，P<0.01)顯著或極顯著高于第8天，粒細(xì)胞比率第0天顯著低于第8天(P<0.05)。攻毒組白細(xì)胞總數(shù)在攻毒第8天顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。血紅蛋白含量(圖1e)均無(wú)差異性(P>0.05)。

*表示P<0.05，**表示P<0.01

2.4 病理組織學(xué)變化

肺臟間質(zhì)輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為核圓形深染的淋巴細(xì)胞和分葉核的中性粒細(xì)胞，支氣管周?chē)梢?jiàn)多量炎細(xì)胞成團(tuán)浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主(圖2a)；肝臟血管內(nèi)見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞邊緣化，組織少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2b)；脾臟紅髓內(nèi)少量含鐵血黃素沉積(圖2c)；氣管固有層細(xì)胞灶性壞死，并伴有較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，周?chē)凸逃袑酉轮窘M織內(nèi)輕度出血，見(jiàn)紅細(xì)胞溢出血管(圖2d)；腎小球玻璃樣變，腎小囊腔內(nèi)數(shù)量不等的嗜伊紅圓形小體沉積，腎小管上皮空泡變性，見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)含大小不等的空泡(圖2e)。

a.肺臟間質(zhì)輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn);b. 肝臟少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);c. 脾臟紅髓內(nèi)含鐵血黃素沉積;d.氣管固有層細(xì)胞灶性壞死;e. 腎小球玻璃樣變、腎小管上皮空泡變性

2.5 病原學(xué)檢測(cè)

2.5.1 Mmc-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

從圖3可見(jiàn)，基因組參考品起始模板濃度與對(duì)應(yīng)的Ct值表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2=0.997，其擴(kuò)增效率E=91.7%，直線方程是y=-3.537log(x)+49.260。

圖3 qPCR檢測(cè)Mmc的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 攻毒羊組織樣品檢測(cè)

共獲得23份攻毒羊各部位組織樣品，其中心臟3份、肝臟3份、脾臟3份、肺臟3份、腎臟3份、血液3份、皮下水腫液2份、氣管滲出物2份、尿液1份。除尿液樣品分離培養(yǎng)為陰性外，其余均為陽(yáng)性。qPCR檢測(cè)結(jié)果一致，尿液樣未檢出Mmc。

用qPCR比較攻毒羊各組織器官M(fèi)mc含量(表2)，其中含量較高的為肺臟(Ct值為16～17)和脾臟(Ct值為17～18)。

表2 qPCR檢測(cè)對(duì)照組與攻毒組羊各組織中Mmc含量

3 討論

本試驗(yàn)利用一定劑量的Mmc分離株培養(yǎng)物人工感染山羊進(jìn)行致病性觀察，臨床癥狀與剖檢與已發(fā)表文獻(xiàn)[15]描述一致。病理學(xué)觀察結(jié)果由于病程短，組織臟器發(fā)現(xiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，除氣管出現(xiàn)灶性壞死，其余組織細(xì)胞未見(jiàn)明顯病理變化，間接血凝血清抗體檢測(cè)由于感染時(shí)間短，因此尚未轉(zhuǎn)陽(yáng)。血常規(guī)變化顯示白細(xì)胞總數(shù)、中間細(xì)胞比率、紅細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比率攻毒前后存在顯著差異性，血紅蛋白均無(wú)差異性，提示山羊機(jī)體組織損傷、炎癥反應(yīng)、貧血脫水及紅細(xì)胞損傷。qPCR均能夠從心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、血液、皮下水腫液等檢測(cè)到Mmc的DNA，檢出含量較高的組織器官為肺臟(Ct：16～17)和脾臟(Ct：17～18)。這些結(jié)果，均可說(shuō)明Mmc可引起山羊嚴(yán)重的急性呼吸道癥狀、急性炎癥和全身性臟器病理?yè)p傷，與文獻(xiàn)中記載Mmc可導(dǎo)致MAKePS一致[1-6]。

Mmc是一種系統(tǒng)性感染病原，盡管是我國(guó)報(bào)道的羊支原體肺炎病原之一[1-3,11]，但與我國(guó)流行的其他兩種羊支原體肺炎病原(Mccp和Mo)只引起肺臟、胸腔等呼吸道癥狀不同，Mmc對(duì)宿主毒力和致死性可能更強(qiáng)。目前，我國(guó)Mmc分布、危害等流行病學(xué)資料較少，可能是由于支原體不易培養(yǎng)，不是病原學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，導(dǎo)致支原體病原常被自然忽視和漏檢。但隨著我國(guó)奶羊產(chǎn)業(yè)規(guī)模擴(kuò)大和產(chǎn)業(yè)興起，加強(qiáng)對(duì)能引起傳染性無(wú)乳癥和支原體肺炎的Mmc檢測(cè)和調(diào)查，對(duì)我國(guó)奶羊產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展非常重要。

總之，本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室初步證實(shí)了Mmc的系統(tǒng)性感染特點(diǎn)，確定了關(guān)鍵致病表現(xiàn)和病理變化特征。下一步將通過(guò)劑量分組和不同接種途徑，探索建立Mmc人工感染山羊模型，為Mmc防控技術(shù)研究提供支撐。