陳芙，袁婷，郝華芳，儲岳峰，顏新敏*，王鵬雁

(1. 中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046;2. 石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832001)

羊支原體肺炎(Mycoplasma pneumonia of sheep and goats,MPSG)在我國長期普遍流行，危害巨大。MPSG病原復雜，根據(jù)文獻報道，我國MPSG的病原至少包括：山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae, Mccp)、綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)和絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)等[1-3]。這3種病原引起的疾病臨床表現(xiàn)以肺炎、胸膜炎等呼吸系統(tǒng)癥狀為主，但文獻報道Mmc還可導致乳腺炎、關節(jié)炎、角膜炎和敗血癥等綜合征(MAKePS)，是傳染性無乳癥(contagious agalactia, CA)的病原之一[4-6]。本實驗室前期對由Mccp和Mo引起的羊支原體肺炎進行了較為系統(tǒng)的研究，已通過構建人工感染模型等工作研發(fā)了相應的疫苗和診斷試劑，并實現(xiàn)了產業(yè)化[7-8]。但目前對Mmc感染的防控技術研究，國內外報道的不多[9-11]。建立有效的動物模型是深入了解病原致病機制和研發(fā)疫苗等防控技術的基礎。本文采用Mmc國內分離株對山羊進行人工感染試驗觀察，初步了解Mmc感染后山羊的臨床表現(xiàn)和病理特征，為下一步建立Mmc人工感染模型和我國MPSG病原學研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

絲狀支原體山羊亞種Mm1901株，中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存。

1.2 試驗動物

來自甘肅榆中某羊場的6月齡左右、體重12 kg中衛(wèi)白山羊6只，隨機平均分為2組，攻毒組和對照組。熒光定量PCR(qPCR)檢測鼻拭子樣品中Mmc核酸[12]，間接血凝試驗檢測Mmc抗體[13]皆為陰性。

1.3 試驗試劑

MTB和MTA培養(yǎng)基，參考文獻[1]制備。PremixTaq和DNA Marker DL2000，購自大連寶生物有限公司；細菌DNA提取試劑盒和組織DNA提取試劑盒(離心柱型)，購自天根生化科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 攻毒菌液準備

用MTB培養(yǎng)基按照1∶10比例接種復蘇Mm1901株F2代凍存菌液，經傳代2次擴大培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃后8 000 r/min離心15 min進行10倍濃縮，將離心菌體與10 mL上清液混合濃縮后作為攻毒菌液。同時測定菌液的菌落形成單位(CFU)(結果為1.0×109CFU/mL)，并接種血平皿做無菌檢測(應無菌生長)。

1.4.2 人工感染

人工感染程序參考文獻[14]進行：第1天鼻腔噴霧攻毒2 mL/只，每個鼻孔各1 mL；第2天同樣噴霧感染；第5天氣管注射6 mL/只。對照組噴鼻和注射同樣體積的生理鹽水[8-10]。

從第0天開始，每天測量體溫，記錄臨床表現(xiàn)，攻毒前后、剖檢前取全血測定血常規(guī)。

死亡(鼻腔攻毒后第8天，攻毒程序結束后第3天)和瀕臨死亡羊剖檢并記錄病變，同時取肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、氣管等組織樣品進行支原體病原學檢測，并送成都里來生物科技有限公司做病理觀察。

1.4.3 Mmc病原學檢測

1.4.3.1 引物及反應體系、程序

根據(jù)文獻[12]合成引物(見表1)，并按照已公布的反應體系及反應條件進行。反應體系：SYBR PremixExTaqⅡ(2×) 12.5 μL，Mmc-1700F 0.5 μL，Mmc-1770R 0.5 μL，模板2 μL，水補足至25 μL。反應條件：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

表1 引物信息

1.4.3.2 標準曲線的建立

將復蘇的菌液提取DNA，測定濃度并計算拷貝數(shù)，調整濃度為1.0×109拷貝數(shù)/μL后進行10倍梯度稀釋，取1.0×108～1.0×102拷貝數(shù)/μL共7個濃度梯度樣品，作為模板按反應體系與反應條件進行擴增，以各梯度起始模板濃度之對數(shù)值為x軸，以反應之Ct值為y軸，繪制標準曲線。

1.4.3.3 樣品檢測

將剖檢獲取的各組織樣品組織研磨，試劑盒提取DNA，同時進行分離培養(yǎng)，對陽性培養(yǎng)物提取DNA，同時利用合成的引物進行qPCR定量檢測組織。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Graphpad Prism 5軟件，對血常規(guī)參數(shù)進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA) 。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

山羊鼻腔接種培養(yǎng)物后無明顯臨床表現(xiàn)，但氣管攻毒后第2 天體溫明顯上升，最高可達41.2 ℃，并出現(xiàn)精神沉郁、食欲廢絕、精神異常(臥地或呆立)、頭頸僵直、背腰拱起、腹肋緊縮、咳嗽、口鼻流涎、呼吸極度困難(張口呼吸)、顫動，胸部按壓有痛感等臨床癥狀。其中1只羊在氣管攻毒后第3天(噴鼻后第8 天)死亡，其余2只羊瀕死，同時處死、剖檢。

2.2 剖檢變化

全部攻毒羊頸部皮下水腫嚴重(下頜至胸前)，氣管上有出血點，呼吸道內含有泡沫樣物質，氣管被膠凍樣滲出物包裹。肺淤血、出血，大部分肺組織紅色肉變，縱膈、肺門淋巴結淤血。腎臟表面、皮質有淤血和出血點。脾臟有淤血、梗死灶。心臟水腫有心包積液，透明無色，左心耳淤血。瘤胃鼓氣，瓣胃、真胃無食。

2.3 血液參數(shù)變化

使用Graphpad Prism 5軟件對攻毒組與對照組山羊在攻毒前后時間點的組間及組內進行血液參數(shù)分析，其中對照組在第0天和第8天均無差異性(P>0.05)。攻毒組第0天白細胞總數(shù)(圖1a，P<0.05)、中間細胞比率(圖1b，P<0.01)、紅細胞總數(shù)(圖1c，P<0.01)顯著或極顯著高于第8天，粒細胞比率第0天顯著低于第8天(P<0.05)。攻毒組白細胞總數(shù)在攻毒第8天顯著低于對照組(P<0.05)。血紅蛋白含量(圖1e)均無差異性(P>0.05)。

*表示P<0.05，**表示P<0.01

2.4 病理組織學變化

肺臟間質輕度炎細胞浸潤，主要為核圓形深染的淋巴細胞和分葉核的中性粒細胞，支氣管周圍可見多量炎細胞成團浸潤，以淋巴細胞為主(圖2a)；肝臟血管內見少量中性粒細胞邊緣化，組織少量炎細胞浸潤(圖2b)；脾臟紅髓內少量含鐵血黃素沉積(圖2c)；氣管固有層細胞灶性壞死，并伴有較多炎細胞浸潤，以淋巴細胞為主，周圍和固有層下脂肪組織內輕度出血，見紅細胞溢出血管(圖2d)；腎小球玻璃樣變，腎小囊腔內數(shù)量不等的嗜伊紅圓形小體沉積，腎小管上皮空泡變性，見胞質內含大小不等的空泡(圖2e)。

a.肺臟間質輕度炎細胞浸潤;b. 肝臟少量炎性細胞浸潤;c. 脾臟紅髓內含鐵血黃素沉積;d.氣管固有層細胞灶性壞死;e. 腎小球玻璃樣變、腎小管上皮空泡變性

2.5 病原學檢測

2.5.1 Mmc-qPCR標準曲線建立

從圖3可見，基因組參考品起始模板濃度與對應的Ct值表現(xiàn)出良好的線性關系，其相關系數(shù)R2=0.997，其擴增效率E=91.7%，直線方程是y=-3.537log(x)+49.260。

圖3 qPCR檢測Mmc的標準曲線

2.5.2 攻毒羊組織樣品檢測

共獲得23份攻毒羊各部位組織樣品，其中心臟3份、肝臟3份、脾臟3份、肺臟3份、腎臟3份、血液3份、皮下水腫液2份、氣管滲出物2份、尿液1份。除尿液樣品分離培養(yǎng)為陰性外，其余均為陽性。qPCR檢測結果一致，尿液樣未檢出Mmc。

用qPCR比較攻毒羊各組織器官Mmc含量(表2)，其中含量較高的為肺臟(Ct值為16～17)和脾臟(Ct值為17～18)。

表2 qPCR檢測對照組與攻毒組羊各組織中Mmc含量

3 討論

本試驗利用一定劑量的Mmc分離株培養(yǎng)物人工感染山羊進行致病性觀察，臨床癥狀與剖檢與已發(fā)表文獻[15]描述一致。病理學觀察結果由于病程短，組織臟器發(fā)現(xiàn)不同程度的炎性細胞浸潤，除氣管出現(xiàn)灶性壞死，其余組織細胞未見明顯病理變化，間接血凝血清抗體檢測由于感染時間短，因此尚未轉陽。血常規(guī)變化顯示白細胞總數(shù)、中間細胞比率、紅細胞總數(shù)、中性粒細胞比率攻毒前后存在顯著差異性，血紅蛋白均無差異性，提示山羊機體組織損傷、炎癥反應、貧血脫水及紅細胞損傷。qPCR均能夠從心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、血液、皮下水腫液等檢測到Mmc的DNA，檢出含量較高的組織器官為肺臟(Ct：16～17)和脾臟(Ct：17～18)。這些結果，均可說明Mmc可引起山羊嚴重的急性呼吸道癥狀、急性炎癥和全身性臟器病理損傷，與文獻中記載Mmc可導致MAKePS一致[1-6]。

Mmc是一種系統(tǒng)性感染病原，盡管是我國報道的羊支原體肺炎病原之一[1-3,11]，但與我國流行的其他兩種羊支原體肺炎病原(Mccp和Mo)只引起肺臟、胸腔等呼吸道癥狀不同，Mmc對宿主毒力和致死性可能更強。目前，我國Mmc分布、危害等流行病學資料較少，可能是由于支原體不易培養(yǎng)，不是病原學檢測實驗室常規(guī)檢測項目，導致支原體病原常被自然忽視和漏檢。但隨著我國奶羊產業(yè)規(guī)模擴大和產業(yè)興起，加強對能引起傳染性無乳癥和支原體肺炎的Mmc檢測和調查，對我國奶羊產業(yè)健康發(fā)展非常重要。

總之，本試驗在實驗室初步證實了Mmc的系統(tǒng)性感染特點，確定了關鍵致病表現(xiàn)和病理變化特征。下一步將通過劑量分組和不同接種途徑，探索建立Mmc人工感染山羊模型，為Mmc防控技術研究提供支撐。