陳雪霏, 唐彬鋮，胡博，劉賀賀，胡繼偉，胡深強，韓春春，何樺，王繼文，李亮

( 四川農業(yè)大學動物遺傳育種與繁殖研究院，四川 成都 611130 )

肝臟作為脂質代謝的主要器官之一，對脂質具有吸收、合成、氧化和分泌的能力，并且這些過程都會影響肝臟的脂質含量[1]。當肝臟中甘油三酯(TG)含量超過肝臟總重量的5%時，TG的生成速度快于極低密度脂蛋白(VLDL)，臨床上將其定義為脂肪肝。脂肪肝存在于許多動物中，如長途遷徙的野鳥和哺乳期的奶牛[2]。作為候鳥的后代，鵝具有從重度脂肪肝中恢復的能力，且無明顯的病理癥狀[3]，表明鵝存在一種調節(jié)機制能保護其肝臟免受嚴重脂肪肝的影響。在實際生產中，鵝肥肝是對鵝進行短時間碳水化合物填飼導致大量 TG 沉積于肝臟的產物，富含不飽和脂肪酸(60%以上)、人類必須氨基酸和卵磷脂，具有降血脂、降膽固醇和預防心腦血管等疾病的功能[4]。相反，哺乳動物非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種代謝性疾病，通常伴有炎癥和肝硬化。中國長三角等發(fā)達地區(qū)NAFLD患病率逐年上升，而肥胖是導致哺乳動物脂肪肝的主要原因[5]，若患者還伴隨有糖尿病等疾病，機體內環(huán)境和免疫系統(tǒng)功能受損，不能清除異常的變異細胞，還會發(fā)生癌變[6]。與哺乳動物中的NAFLD類似，鵝脂肪肝與能量攝入過多(如高糖或高脂飲食)有關[7]，表明鵝可能與哺乳動物存在一些共同之處，使得鵝成為肝臟脂質代謝獨特的研究模型。因此，通過對鵝肝脂質代謝調節(jié)機制的研究，可為NAFLD以及鵝肥肝的形成提供借鑒和參考。

長非編碼RNA(long non-codingRNAs，lncRNAs)是長度大于200 nt且不編碼蛋白質的RNA轉錄本。lncRNA可通過與DNA、RNA或蛋白結合在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平控制基因的表達，因此與mRNA相比更具有多樣性，功能更繁復[8]。隨著高通量測序等先進技術的發(fā)展，越來越多l(xiāng)ncRNA的調控作用被發(fā)現(xiàn)并用于相關疾病的治療，包括X-染色質激活、p53介導的細胞凋亡、癌癥轉移以及重新編程誘導多能干細胞，其作用范圍幾乎涉及到生命活動的所有方面[9]。目前，在脂質代謝方面，已通過RNA-seq和生物信息學分析鑒定了許多與脂質代謝相關的lncRNA。如在雞腹部脂肪前體細胞分化的不同階段發(fā)現(xiàn)了1 336個差異表達的lncRNAs，涉及糖脂代謝、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號通路[10]。通過對填飼前后的鵝肝進行高通量測序發(fā)現(xiàn)302個差異表達的lncRNAs，其中l(wèi)nc-005028表達水平在填飼后發(fā)生了顯著下降[11]。然而，這些脂質代謝相關的lncRNA在家禽上的功能研究很少。因此，進一步開展脂質代謝相關lncRNA的功能研究，可為探討lncRNA調節(jié)家禽脂質代謝的機制提供參考和借鑒。本試驗將研究lnc-005028的序列及其在鵝肥肝形成過程中的可能作用，可為研究鵝肥肝形成機制提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

所有動物處理程序均經四川農業(yè)大學動物福利委員會批準，所用試驗動物四川白鵝來源于四川農業(yè)大學家禽飼養(yǎng)試驗場。將12只14周齡健康四川白鵝公鵝隨機分為填飼組和對照組，每組6只，其中填飼組所用飼料為煮熟并鹽漬的玉米(14 MJ/kg，9%蛋白質和0.45%脂肪)、0.4%水禽脂肪和水，填飼步驟參照文獻[12]；對照組自由采食，飼料喂煮熟玉米。在過度喂養(yǎng)期間，所有的鵝都可以自由飲水。保持室溫15～18 ℃，濕度70%～80%，持續(xù)2周，最后12 h僅為2組試驗動物提供自由飲水，在試驗第14天時取填飼組和對照組四川白鵝的部分肝臟、心臟、腎臟、腿肌、胸肌、皮脂和腹脂于2 mL離心管，儲存于-80 ℃冰箱待用。

1.2 lnc-005028的克隆與序列分析

引物采用Primer Premier 5軟件(Primer Biosoft International, Palo Alto, USA)設計并由北京六合華達基因科技有限公司(中國)合成(表1)。將純化的PCR產物連接到pMD19-T載體(TaKaRa, Japan)中，轉化為大腸桿菌DH5α細胞后冰浴30 min，接著42 ℃水浴45 s，冰浴2 min，隨后移入800 mL液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床，速度150 r/min，45 min后取出菌液，8 000 r/min離心5 min，棄800 mL上清液后，混勻分散打到固體培養(yǎng)基上，用涂抹棒向一個方向畫圓涂抹均勻，放入37 ℃恒溫箱，30 min后翻板，12 h后挑菌，37 ℃搖床，速度175 r/min，時間不少于4 h。陽性克隆產物由北京六合華大基因科技有限公司篩選測序，測序得到的cDNA片段用Editseq和Seqman編輯組裝(DNAStar, Inc., Madison, USA)。

1.3 鵝原代肝細胞分離與培養(yǎng)

將8日齡禁食12 h后的四川白鵝靜脈注射戊巴比妥鈉(每千克體重30 mg)使其完全昏迷，再靜脈注射肝素鈉(100 IU/kg)。腹部切開后取出全肝，立即用37 ℃生理鹽水清洗表面。用100 mL 0.05% IV型膠原酶灌流液(GIBCO, USA)反復灌流至包膜下組織裂開，撕開后膜，切肝，置37 ℃水浴中振蕩10 min。搖勻后加入含10%胎牛血清(Clark, Australia)的5 mL高糖培養(yǎng)基DMEM(GIBCO，USA)終止消化，200 目無菌過濾器過濾。濾液在室溫下以950 r/min離心2 min，用含10%胎牛血清的DMEM稀釋沉淀后，以細胞3×105個/mL的密度接種于12孔細胞培養(yǎng)板中。5% CO2和37 ℃下培養(yǎng)6 h后用PBS洗滌3次，用含有10%牛血清白蛋白(BSA)和2% BSA的DMEM稀釋棕櫚酸(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)和油酸(0.25、0.5、0.75、1 mmol/L)并對原代肝細胞進行處理，對照組僅用10% BSA和2% BSA的DMEM 處理，24 h后用PBS清洗并收集原代肝細胞。每個試驗均設置3個重復。

1.4 總RNA提取和熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測

根據(jù)TRIzol(Invitrogen, USA)說明書對組織和細胞樣品的總RNA進行提取和純化，并分別用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法(UV-1201; Shimadzu, Japan)檢測總RNA的數(shù)量和質量。qRT-PCR擴增反應混合物(12.5 mL)中含有6.25 mL SYBR?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa, China)，各0.5 mL正反向引物(10 mmol/L)，1 mL cDNA和4.25 mL ddH2O，ddH2O代替引物反應作為空白對照。將混合物500 r/min離心5 min后，95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，特定溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個循環(huán)；最后72 ℃延長10 min。設計引物：脂肪酸氧化相關基因：肉堿棕櫚酰轉移酶1(CPT1)、PPARα；TG合成相關基因：二?；视王；D移酶2(DGAT2)、長鏈脂肪酸延長酶(ELOVL6)；促進炎癥基因：白細胞介素-6(IL-6)；促進凋亡基因：半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)(表1)。使用Roche LightCycler?480 Ⅱ(Roche, Switzerland)對陰性對照(ddH2O為模板)進行PCR擴增，并通過β-actin和GADPH對基因表達數(shù)據(jù)進行標準化。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計分析

基因的相對表達水平用標準化相對定量法和2-ΔΔCt法計算。使用IBM SPSS統(tǒng)計軟件(Version 22.0, 2014)Student’st檢驗法進行分析。所有結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 序列信息與蛋白質編碼能力

通過測序結果發(fā)現(xiàn)lnc-005028共有1 066 bp，將獲得的序列與NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上鵝轉錄組NW_013185654.1:10248135-10249201的序列相對比，匹配率為99.34%，差異表現(xiàn)為MN_.1:n.234A>G，MN_.1:n.628C>T，MN_.1:n.898T>A，MN_686114.1:n.898T>A。

通過ORFfinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder) 在lnc-005028中共發(fā)現(xiàn)18個開放閱讀框(ORF)，長度均小于200 nt，所有正義短肽(+)均與同源蛋白不匹配(表2)。已將lnc-005028的具體序列提交給NCBI，檢索號為MN686114。

表2 lnc-005028序列中的ORF

2.2 填飼對lnc-005028的影響

lnc-005028在填飼組和對照組四川白鵝的肝臟、腎臟、心臟、胸肌、腿肌、皮脂和腹脂中均有表達(圖1)。在對照組中，lnc-005028在肝臟中的表達水平極顯著高于其他組織(P<0.01)。與對照組相比，填飼組鵝肝臟中l(wèi)nc-005028表達水平出現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)，但腎臟、脾臟、心臟、胸肌、腿肌、皮脂和腹脂中l(wèi)nc-005028表達量均出現(xiàn)極顯著上升(P<0.01)。在填飼組中，肝臟中l(wèi)nc-005028的表達量與皮脂無顯著性差異(P>0.05)，但仍極顯著高于其他組織(P<0.01)。

相同組織組間比較，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)；同一處理組不同組織與肝臟相比，**表示P<0.01

2.3 棕櫚酸對鵝原代肝細胞lnc-005028的影響

根據(jù)qRT-PCR研究結果，lnc-005028在鵝原代肝細胞中的表達水平不隨油酸濃度的增加而變化(P>0.05)(圖2A)，而在棕櫚酸的處理下，lnc-005028呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在0.2 mmol/L時表達量達到最高，在0.6 mmol/L時達到最低(P<0.01)(圖2B)。隨后在不同濃度棕櫚酸處理過的鵝原代肝細胞中檢測了caspase-3、CPT1、DGAT2、ELOVL6、IL-6和PPARα，結果發(fā)現(xiàn)，PPARα、caspase-3和IL-6 在0.2 mmol/L棕櫚酸濃度下均顯著升高(P<0.01)，但只有caspase-3在0.4和0.6 mmol/L時顯著下降(P<0.01)，在0.8 mmol/L時與對照組無顯著差異(P>0.05)(圖2C)。

與對照(NC)組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01

3 討論

分子生物學研究的焦點以往大部分集中在蛋白質編碼基因上，lncRNA在發(fā)現(xiàn)之初被認為是基因轉錄噪音而一直被忽視。除了ORF，lncRNA一般與mRNA無生化區(qū)別，但其長度普遍更短，具有較少且較長的外顯子，一級序列保守性低，細胞特異性、組織特異性和不同發(fā)育階段的疾病特異性更強[13]。先前的研究通過高通量測序發(fā)現(xiàn)lnc-005028屬于鵝的lncRNA，本試驗確定lnc-005028總長1 066 bp,在鵝的肝臟中特異性高表達，且ORF均無蛋白編碼能力，再一次驗證lnc-005028屬于鵝lncRNA一員。

lncRNA控制代謝組織的發(fā)育和功能，包括棕色和米色脂肪細胞分化、肝臟脂質代謝、骨骼和心肌發(fā)育等，是多種生物過程中必不可少的調節(jié)因子[14]。lncRNA可通過調節(jié)細胞生長、凋亡、神經疾病進展和癌癥轉移成為脂質代謝的調控因子，尤其是調控脂肪生成、脂肪酸、膽固醇和磷脂代謝和轉運，以及高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的形成，從而參與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展[15]。肝臟在多種代謝調控中起著舉足輕重的作用，包括葡萄糖和脂質代謝、膽汁酸合成、異生化合物的解毒功能以及大量血漿蛋白的分泌[16]。肺腺癌轉移相關轉錄子1(MALAT1)是最早發(fā)現(xiàn)的與癌癥轉移和預后有關的lncRNA，能通過上調沉默調節(jié)蛋白(SIRT1)[17]或作為miR-101b的ceRNA調節(jié)Rac1的表達[18]。在丙型肝炎病毒感染引起的肝纖維化中，轉化生長因子-β(TGF-β)活化lncRNA(ATB)與β-catenin 表達均增加[19]。肝癌上調基因(HULC)是第一個在肝癌細胞中特異性高表達的lncRNAs，它誘導miR-9啟動子的CpG島甲基化，并在轉錄后水平下調miR-9靶向PPARα的能力。lncRNA不僅可以促進肝臟的纖維化，也可以抑制脂肪肝的形成。研究發(fā)現(xiàn)，用四氯化碳誘導人與鼠的肝臟發(fā)生纖維化后，母系印記基因3(MEG3)表達水平明顯下降，過表達MEG3能激活p53并介導細胞色素C的釋放，從而引起caspase-3依賴的造血干細胞(HSCs)凋亡[20]。lncLSR可以抑制VLDL介導的TG代謝，減少胰島素抵抗的發(fā)生，抑制脂肪肝[21]。本試驗對四川白鵝進行填飼后，lnc-005028在鵝肝中的表達發(fā)生了顯著下降，不再呈現(xiàn)組織特異性，提示肝臟脂質代謝的狀態(tài)可以影響lnc-005028的表達。在細胞試驗中，經棕櫚酸處理的原代肝細胞lnc-005028表達水平變化趨勢與鵝肝不同，而油酸沒有顯著性影響，這是因為雖然脂肪酸形成相關因子均會促進TG沉積，引起細胞變形，但并非所有因子對同一基因調控結果一致[22]。

在鵝肥肝生成過程中，脂肪酸合成通路中的功能蛋白，如乙酰輔酶羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、超長鏈脂肪酸延伸蛋白6(ELOVL6)等在TG在肝中快速沉積后，mRNA的表達水平均出現(xiàn)一個顯著下調的過程[23]。李富原等[24]將填飼鵝與對照鵝的轉錄本進行對比，發(fā)現(xiàn)352個lncRNA存在顯著差異，其中212個表達量顯著上升，且LOCl06047490與鵝肥肝的形成密切相關，受高葡萄糖、胰島素和不飽和脂肪酸的誘導[25]。鵝肝形成過程中涉及脂肪酸氧化、TG合成、炎癥和凋亡等方面。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度棕櫚酸處理下，CPT1、 ELOVL6、DGAT2、PPARα和IL-6 表達水平變化趨勢與lnc-005028存在差異性，唯有caspase-3表現(xiàn)出一致性。蛋白水解酶的激活是凋亡程序的一個特征，包括ced-3/ICE家族中的某些胱氨酸蛋白酶，而caspase-3是胱氨酸蛋白酶的ced-3/ICE家族成員，參與通過B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)家族誘導的凋亡途徑，caspase-3抑制劑可降低MG132誘導的細胞凋亡[26]。此外，caspase-3參與了HIV-Env介導的細胞凋亡[27]，是HIV-gp41介導的細胞凋亡中活性氧(ROS)生成的關鍵調節(jié)因子[28]。lnc-005028受飽和脂肪酸調節(jié)，與棕櫚酸影響的caspase-3表達一致。以上結果提示lnc-005028可能通過凋亡途徑參與鵝原代肝細胞脂質代謝，但其具體調控機制有待進一步研究。