蔣藎芳，楊宇勤，王 恒，朱嬌三，王明珊，成 鑫

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬航天醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563000)

作為社區(qū)獲得性感染及醫(yī)院感染的重要病原菌之一，金黃色葡萄球菌，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)可引起肺炎、支氣管炎、皮膚軟組織感染、膿毒癥、腦膿腫等疾病[1-2]。流行病學(xué)研究表明，MRSA感染主要以克隆群播散為主，不同地區(qū)流行的金黃色葡萄球菌克隆群不盡相同。如克隆群8(CC8)主要流行于美洲，CC22和CC30主要流行于歐洲，而CC239(ST239)主要流行于亞洲。在我國(guó)，攜帶Ⅲ型SCCmec的CC239占臨床MRSA分離株的50%以上，包括2個(gè)主要的亞群，ST239-MRSA-Ⅲ-t037和ST239-MRSA-Ⅲ-t030[3]。

金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生如脂蛋白(Lpp)、溶血素、血漿凝固酶等致病因子[4]。在金黃色葡萄球菌的基因組中，Lpp的編碼基因有55～70種，主要參與生物信號(hào)傳遞、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞膜的穩(wěn)定等[5]。金黃色葡萄球菌中約30% Lpp的作用目前尚還不清楚，研究發(fā)現(xiàn)，這些功能不明的Lpp序列，與已知的Lpp存在一定差異，它們?nèi)狈Φ湫偷闹薪Y(jié)構(gòu)，故又被稱之為脂蛋白樣蛋白(Lpl)[5]。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的Lpl可分泌到細(xì)胞外，具有激活TLR2依賴的信號(hào)途徑，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生過(guò)度的炎性反應(yīng)，這可能是金黃色葡萄球菌引起膿毒癥的機(jī)制之一[6]。

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物常用于預(yù)防感染[7]，低劑量的抗菌藥物可產(chǎn)生信號(hào)誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致細(xì)菌胞外釋放DNA、生物膜形成、產(chǎn)生毒力因子，從而加重細(xì)菌感染[8-9]。除具有抗菌作用外，亞抑菌濃度的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物還誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌分泌腸毒素、α-溶血素、葡萄球菌A蛋白、殺白細(xì)胞毒素等，促進(jìn)細(xì)菌的致病性[8,10]。由此可見(jiàn)，經(jīng)驗(yàn)性使用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，在一定程度上不但不能抑制或殺滅MRSA，而且可能促進(jìn)該菌的致病作用，加重感染。探討亞抑菌濃度β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物在誘導(dǎo)MRSA毒力基因表達(dá)中的作用，對(duì)深入了解MRSA致病性增強(qiáng)的原因和指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物具有重要意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株、質(zhì)粒與試劑 MRSA菌株由陸軍軍醫(yī)大學(xué)饒賢才教授課題組惠贈(zèng)[11]。大腸埃希菌DH5α，BL21和表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)從北京天根(Tiangen)生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司。細(xì)菌培養(yǎng)基LB、BHI和TSB均購(gòu)自O(shè)xoid公司。

1.2方法

1.2.1MRSA對(duì)不同抗菌藥物的敏感性測(cè)定 挑取待測(cè)的MRSA菌株單菌落，在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，次日1∶100接種于BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min，至OD600約2.0左右(約6 h)，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)或生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞舛?，約1×108～2×108cfu/mL，再用BHI液體培養(yǎng)基稀釋為100倍的菌懸液備用；將選用的抗菌藥物(利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、苯唑西林、替考拉寧、克林霉素、利福平、復(fù)方新諾明)配制成2 048 μg/mL。取11支無(wú)菌試管，每管加入BHI液體培養(yǎng)基1 mL。在第1管中加入1 mL 濃度為2 048 μg/mL的藥物溶液，混勻后，再取1 mL到第2管，依次倍比稀釋至第10管，最后一管不加藥物，從而使各管中抗菌藥物的濃度依次為1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、0 μg/mL。每管加入制備好的菌懸液1 mL，使每管含有約0.5×106～1.0×106cfu/mL，經(jīng)37 ℃ 培養(yǎng)24 h后觀察記錄。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度，即為該菌株對(duì)該藥物的最低抑菌濃度(MIC)，依據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定該菌株對(duì)抗菌藥物是敏感、中介還是耐藥[12]。

1.2.2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 用亞抑菌濃度的苯唑西林(2 μg/mL)誘導(dǎo)處理遴選出的MRSA菌株，并與未經(jīng)處理的菌株一起，電泳分析細(xì)菌的總蛋白。具體方法如下：經(jīng)藥物處理的MRSA，培養(yǎng)結(jié)束后，用10 000 r/min離心2 min，棄上清。菌體用1 mL PBS重懸，加入1 mmol/L 蛋白酶抑制劑(PMSF)，再移到2 mL細(xì)菌破碎管中，加入2 g 0.1 mm氧化鋯研磨珠，冰浴10 min；用MiniBeadbeater-16研磨器研磨5 min，冰浴10 min，重復(fù)3次；把研磨液用20 000 r/min，4 ℃離心10 min，吸取上清，用蛋白質(zhì)定量(BCA法)定量后，取30 ng總蛋白樣品，加入60 μL PBS和15 μL 5×SDS上樣Buffer重懸，采用分子克隆中描述的方法，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色分析。

1.2.3pET28a-lpl/BL21重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建 根據(jù)MRSA菌株N315基因組中l(wèi)pl基因序列，設(shè)計(jì)引物F:5′-aacggatcctgcggaatgaaaaaggaag-3′(含BamHⅠ位點(diǎn))和引物R:5′-agcgtcgacctattcagtaggtttgaaatt-3′(含SalⅠ位點(diǎn))。以N315的基因組DNA為模板，擴(kuò)增lpl目標(biāo)基因片段，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后，與pET28a(+)載體連接，再轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α。挑選卡那霉素抗性的菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒用PCR擴(kuò)增，酶切及DNA測(cè)序鑒定，含正確編碼序列的質(zhì)粒命名為pET28a-lpl，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，獲得pET28a-lpl/BL21重組表達(dá)工程菌。

1.2.4Lpl-his重組蛋白的表達(dá)與純化 復(fù)蘇pET28a-lpl/BL21工程菌，次日按1∶100比例接種于300 mL LB液體培養(yǎng)基中(含KAN 50 μg/mL)，37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 達(dá)0.5左右，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，22 ℃，150 r/min誘導(dǎo)表達(dá)12 h。收集菌液4 ℃，5 000 r/min離心15 min，棄上清。菌體經(jīng)PBS重懸，5 000 r/min離心15 min，棄上清。用大腸埃希菌破碎緩沖液20 mL重懸菌體，再用ATS高壓均質(zhì)機(jī)高壓破碎菌液，10 000 r/min，4 ℃離心30 min，收集上清，經(jīng)0.45 μm的針式濾器過(guò)濾。用GE公司的Ni層析柱純化，收集各洗脫峰蛋白樣品后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，獲得的重組蛋白用BCA法定量后，置-80 ℃冰箱保存。

1.2.5制備Lpl-his重組蛋白小鼠多克隆抗體 取純化的Lpl-his蛋白40 μg，與等體積的Freund′s佐劑混勻，經(jīng)肌肉、腹腔、皮下多點(diǎn)免疫小鼠，并分別于14 d，28 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，35 d后眼球取血制備血清，經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾，命名為anti-Lpl，-20 ℃凍存。

1.2.6苯唑西林誘導(dǎo)LPI表達(dá)的Western blot鑒定 各MRSA菌株經(jīng)亞抑菌濃度的苯唑西林誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，至溴酚藍(lán)泳動(dòng)到凝膠底部；小心取出凝膠，浸入到1×半干轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min。依次按照厚濾紙、PVDF膜、凝膠、厚濾紙的順序，疊放到Trans-blot半干轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)，驅(qū)逐氣泡后，在15 V條件下轉(zhuǎn)膜30 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束，將聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST溶液)漂洗1 min后，置于5%脫脂奶粉封閉液中，室溫?fù)u蕩封閉1 h；向封閉液中加入制備的anti-lpl多克隆抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜；次日，用PBST將PVDF膜洗膜5次，每次5 min；將PVDF膜放入用封閉液稀釋(1∶5 000)的羊抗小鼠 IgG中，室溫孵育1 h；PBST洗膜5次，配置好ECL發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像儀成像后，保存。Western blot的印跡條帶采用Image J軟件進(jìn)行處理并根據(jù)條帶灰度進(jìn)行數(shù)字化，計(jì)算每一條帶相對(duì)于Loading control的相對(duì)灰度值，將未用OXA處理菌株的蛋白相對(duì)灰度值調(diào)整為1，計(jì)算誘導(dǎo)后或不同劑量誘導(dǎo)后的蛋白相對(duì)灰度值并作圖。

2 結(jié) 果

2.1臨床菌株的藥敏檢測(cè)結(jié)果 利奈唑胺、萬(wàn)古霉素和替考拉寧對(duì)所有菌株都敏感；克林霉素和苯唑西林對(duì)所有菌株都耐藥；而t030菌株和t037菌株對(duì)利福平和復(fù)方新諾明的敏感性相反，體現(xiàn)ST239-MRSA-Ⅲ-t030和ST239-MRSA-Ⅲ-t037克隆亞群的進(jìn)化存在差異。見(jiàn)表1。

表1 臨床分離MRSA菌株的藥物敏感性

2.2亞抑菌濃度的苯唑西林作用前后金黃色葡萄球菌菌體蛋白的電泳觀察 6株ST239-MRSA-Ⅲ型金黃色葡萄球菌臨床菌株，全部對(duì)苯唑西林(OXA)耐藥，選用亞抑菌濃度的OXA(2 μg/mL)處理金黃色葡萄球菌，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，見(jiàn)圖1。與未處理的菌株相比，OXA處理后的細(xì)菌在約30 kDa處出現(xiàn)一條明顯的條帶(圖中黑色三角所示)金黃色葡萄球菌。

圖1 亞抑菌濃度OXA誘導(dǎo)ST239-MRSA-Ⅲ金黃色葡萄球菌總蛋白的SDS-PAGE電泳分析

2.3OXA處理后蛋白條帶的鑒定 為明確亞抑菌濃度OXA處理ST239-MRSA-Ⅲ金黃色葡萄球菌后出現(xiàn)的蛋白條帶是否為L(zhǎng)pp Lpl,作者構(gòu)建了金黃色葡萄球菌脂蛋白Lpl的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-lp1,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，并用0.5 mM的IPTG重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，見(jiàn)圖2A。含有重組質(zhì)粒的工程菌，在IPTG誘導(dǎo)后，在約33 kDa處出現(xiàn)一明顯的蛋白條帶，其大小與Lpl-His重組蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量相一致。利用重組蛋白N-端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的特性，用Ni層析柱純化Lpl-His蛋白，洗脫峰經(jīng)透析、濃縮、蛋白定量后，用SDS-PAGE電泳分析。見(jiàn)圖2B。用前述的重組蛋白免疫Balb/c小鼠，制備抗血清。利用Lpl抗血清，對(duì)OXA誘導(dǎo)的金黃色葡萄球菌ST239-MRSA-Ⅲ產(chǎn)生的蛋白，經(jīng)Western blot鑒定，見(jiàn)圖3。亞抑菌濃度OXA誘導(dǎo)后，6株ST239-MRSA-Ⅲ金黃色葡萄球菌均出現(xiàn)Lpl蛋白(圖3A)，但不同菌株的表達(dá)量不完全一致(圖3B)。

A.pET28a-lp1/BL21工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)出現(xiàn)一明顯蛋白條帶(黑色箭頭所示)，相對(duì)分子質(zhì)量大小與Lpl-His重組蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量一致；B.Ni柱純化Lpl-His蛋白的SDS-PAGE電泳分析。

A.不同臨床菌株用亞抑菌濃度OXA誘導(dǎo)前后的Western blot結(jié)果。未誘導(dǎo)菌株未出現(xiàn)或出現(xiàn)極弱的印跡條帶，OXA誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的印跡條帶，LC(Loading control)為蛋白上樣對(duì)照；B.Western blot印跡條帶的相對(duì)灰度分析。

2.4亞抑菌濃度誘導(dǎo)ST239-MRSA-Ⅲ金黃色葡萄球菌LpI具有劑量依賴效應(yīng) 為觀察ST239-MRSA-Ⅲ金黃色葡萄球菌Lpl受OXA誘導(dǎo)的特異性，任意選取CQ29菌株，用不同劑量的亞抑菌濃度OXA進(jìn)行處理，Western blot分析結(jié)果顯示，隨OXA濃度的升高，Lpl的量也逐漸升高，且出現(xiàn)2個(gè)主要條帶(圖4)金黃色葡萄球菌。

A.不同劑量OXA誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌CQ29的Western blot結(jié)果。OXA的濃度如圖中標(biāo)示，LC為上樣對(duì)照。B.Western blot印跡條帶的相對(duì)灰度分析。

3 討 論

Lpl，是金黃色葡萄球菌重要的毒力因子，為DUF576家族脂蛋白成員[13-14]。該家族的脂蛋白編碼基因，在基因組上通常為成簇排列，因其結(jié)構(gòu)域的功能未知(DUF)而得名，也是金黃色葡萄球菌的保守抗原[15]。NGUYEN等[16]對(duì)MRSA菌株USA300基因組vSaα基因組島進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因組島可編碼多個(gè)同源串聯(lián)排列的DUF576家族脂蛋白，即Lpl，敲除該基因簇，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞經(jīng)敲除菌株刺激后，表達(dá)炎癥因子的水平和入侵角朊細(xì)胞的能力都顯著減弱，在小鼠腎臟中的定植能力也顯著降低。MRSA菌株N315中含有12個(gè)推定的lpl基因，分屬于4個(gè)基因簇，多數(shù)位于vSaα基因組島上[15]。SHANG等[6]的研究表明，金黃色葡萄球菌中存在lpl基因，該基因受β-內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)，在MRSA致病性中，這些基因的編碼產(chǎn)物發(fā)揮重要作用。但該研究主要基于標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌N315進(jìn)行，至于β-內(nèi)酰胺類抗生素能否誘導(dǎo)臨床分離的金黃色葡萄球菌株產(chǎn)生Lpl尚需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本研究選取了在我國(guó)主要的金黃色葡萄球菌流行克隆群ST239中的2個(gè)亞群(t030和t037)菌株各3株，采用稀釋法來(lái)測(cè)定這些菌株對(duì)臨床常用的抗菌藥物的敏感性，經(jīng)亞抑菌濃度的苯唑西林(2 μg/mL)處理，用SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，受OXA處理的菌株存在一條約30 kDa的蛋白條帶，與SHANG等[6]報(bào)道的結(jié)果一致。為證實(shí)這一誘導(dǎo)出的蛋白為L(zhǎng)pl脂蛋白，我們對(duì)金黃色葡萄球菌lpl基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，獲得了Lpl-His重組蛋白，制備了特異性的小鼠抗血清。Western blot鑒定研究表明，在臨床分離的MRSA菌株中，亞抑菌濃度苯唑西林能夠誘導(dǎo)Lpl的表達(dá)，且未經(jīng)到的菌株幾乎不表達(dá)Lpl，這提示在臨床金黃色葡萄球菌MRSA感染時(shí)，經(jīng)驗(yàn)性使用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，很可能會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)脂蛋白Lpl表達(dá)，而增強(qiáng)菌株的致病性，需要謹(jǐn)慎用藥。

此外，Western blot 分析還證實(shí)，MRSA脂蛋白Lpl的表達(dá)受亞抑菌濃度OXA誘導(dǎo)有劑量依賴效應(yīng)。Western blot檢測(cè)結(jié)果中出現(xiàn)了兩條大小相近的蛋白質(zhì)條帶，這可能由于受OXA誘導(dǎo)的lpl基因組中有3個(gè)串聯(lián)的編碼基因，分別編碼推定分子量為30.8、30.1、30.2 kDa的蛋白質(zhì)[6]，相對(duì)分子質(zhì)量大小相近，蛋白序列相似度高，由第一個(gè)編碼基因制備的Lpl-his重組蛋白多克隆抗體可能除可識(shí)別第一個(gè)Lpl蛋白外，對(duì)另外2個(gè)Lpl蛋白也會(huì)有交叉反應(yīng)，故Western blot檢測(cè)出現(xiàn)2個(gè)條帶，這可能是Lpl基因在金黃色葡萄球菌臨床株CQ29中存在多個(gè)拷貝組成，表達(dá)的Lpls蛋白同源性較高，而相對(duì)分子質(zhì)量略有差異所致[5-6]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度OXA處理后金黃色葡萄球菌MRSA臨床分離株呈現(xiàn)劑量依賴性脂蛋白Lpl表達(dá)上調(diào)，提示該Lpl的表達(dá)增強(qiáng)，在MRSA致病性中可能發(fā)揮重要作用。至于在β-內(nèi)酰胺類抗生素治療時(shí)，體內(nèi)感染的MRSA受抗生素誘導(dǎo)表達(dá)的程度及其對(duì)致病性的影響值得下一步進(jìn)行深入探討。