許永杰，羅振元，葉芝旭，余福勛，王樹(shù)輝

(貴州省人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.兒科;3.中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550002)

人巨細(xì)胞病毒(hCMV)是一種潛伏性雙鏈DNΑ病毒，屬于β皰疹病毒亞科[1]。hCMV感染在臨床上較為普遍，是引起圍生兒病毒性感染的常見(jiàn)病因。hCMV侵入人體后可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期持續(xù)存在，免疫功能正常個(gè)體多表現(xiàn)為無(wú)癥狀感染，但病理性和生理性免疫低下人群，尤其免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟的胎兒、嬰幼兒，其可侵襲多個(gè)器官、系統(tǒng)，造成先天性或圍生期疾病等，且年齡越小易感性越高[2-3]。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)是臨床實(shí)驗(yàn)室診斷hCMV感染的快速檢測(cè)技術(shù)。本文回顧性分析本院2021年2-4月送檢的血液和尿液樣本中hCMV-DNA的FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果，共981例，為臨床合理診斷hCMV感染提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年2-4月進(jìn)行hCMV-DNA檢測(cè)項(xiàng)目的血液和尿液樣本作為研究對(duì)象，回顧性分析2種樣本hCMV-DNA的FQ-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)，并采集有臨床診療價(jià)值的陽(yáng)性標(biāo)本信息，但不涉及患者個(gè)人隱私信息。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器

1.2.1.1試劑 hCMV核酸檢測(cè)試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)，人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)。

1.2.1.2儀器 Genlier96e型FQ-PCR儀(西安天隆科技有限公司)。

1.2.2方法

1.2.2.1尿液于12 000 r/min條件下離心10 min后吸去上清液，在尿沉渣中加入hCMV-DNA檢測(cè)FQ-PCR試劑盒中的DNA提取液50 μL并混勻后在100 ℃金屬浴中放置10 min，最后提取混合液于12 000 r/min條件下離心10 min，其上清液備用于后續(xù)FQ-PCR檢測(cè)。

1.2.2.2乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血緩慢加入到單個(gè)核細(xì)胞提取液試管中并于3 000 r/min條件下離心15 min，之后吸取淋巴細(xì)胞白膜層并用生理鹽水洗滌1次，洗滌后細(xì)胞沉淀同于尿沉渣提取條件下提取hCMV-DNA備用后續(xù)FQ-PCR檢測(cè)。

1.2.2.3實(shí)驗(yàn)步驟 從尿液和血液標(biāo)本的hCMV-DNA提取液中吸取上清液2 μL加入至43 μL FQ-PCR體系。在Genlier96e型FQ-PCR儀上運(yùn)行如下程序：第1階段：預(yù)變性(1個(gè)周期)，93 ℃ 2 min；第2階段：兩步法擴(kuò)增(10個(gè)周期)，93 ℃ 45 s(變性)，55 ℃ 60 s(退火/延伸)；第3階段：兩步法擴(kuò)增(30個(gè)周期)，93 ℃ 30 s(變性)，55 ℃ 45 s(退火/延伸)。FQ-PCR試劑盒中定量參考品稀釋至104、105、106、107copies/mL標(biāo)準(zhǔn)濃度與臨床樣本行相同操作，以建立線(xiàn)性方程用于臨床樣本中hCMV-DNA的定量檢測(cè)。hCMV-DNA定量值低于500 copies/mL判讀為陰性，大于或等于500 copies/mL且小于104copies/mL判讀為弱陽(yáng)性，大于或等于104copies/mL判讀為陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不同類(lèi)型標(biāo)本hCMV感染陽(yáng)性率采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床檢測(cè)樣本中不同性別受檢者h(yuǎn)CMV-DNA陽(yáng)性率分析 981例hCMV-DNA檢測(cè)樣本中男性hCMV-DNA的陽(yáng)性率顯著高于女性(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 981例hCMV-DNA檢測(cè)樣本中不同性別受檢者陽(yáng)性率分析

2.2不同類(lèi)型臨床檢測(cè)樣本hCMV-DNA陽(yáng)性率分析 981例hCMV-DNA檢測(cè)樣本中，尿液樣本的陽(yáng)性檢出率顯著高于血液樣本(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 981例hCMV-DNA檢測(cè)樣本中血液和尿液陽(yáng)性率分析

2.3臨床不同類(lèi)型樣本hCMV-DNA聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析 167例陽(yáng)性樣本中，尿液和血液hCMV-DNA聯(lián)合檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣本數(shù)共91例。收集該91例患者h(yuǎn)CMV-DNA的FQ-PCR數(shù)據(jù)信息，按照定量判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)2種標(biāo)本類(lèi)型的陽(yáng)性率進(jìn)行對(duì)比分析。聯(lián)合檢測(cè)91例陽(yáng)性標(biāo)本中，尿液標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性88例，陰性3例，陽(yáng)性率為96.70%；而血液標(biāo)本陽(yáng)性25例，陰性66例，陽(yáng)性率為27.47%。見(jiàn)表3。

表3 91例聯(lián)合檢測(cè)樣本中血液和尿液hCMV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性率對(duì)比分析

2.4hCMV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性患者的年齡分布特征 收集167例陽(yáng)性樣本來(lái)源患者年齡信息并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，因嬰幼兒免疫力未發(fā)育成熟，易受hCMV感染，且隨年齡增加免疫力逐步增強(qiáng)，機(jī)體不易受巨細(xì)胞病毒感染，故1-12月階段按月份進(jìn)行樣本量統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)2～4個(gè)月的嬰幼兒hCMV-DNA陽(yáng)性率高于其他月齡段。1～9歲階段按年份進(jìn)行樣本量統(tǒng)計(jì)，10歲以上按年齡段進(jìn)行樣本量統(tǒng)計(jì)。見(jiàn)表4。

表4 167例hCMV-DNA陽(yáng)性樣本在不同年齡組的分布情況

3 討 論

hCMV感染在我國(guó)極其廣泛，一般人群hCMV抗體陽(yáng)性率為86%～96%，孕婦約為95%，嬰幼兒期為60%～80%，原發(fā)感染多發(fā)生于嬰幼兒時(shí)期，一旦感染，將持續(xù)終身[4]。在新生兒期檢出病毒DNA是原發(fā)感染的證據(jù)。目前，臨床檢測(cè)hCMV感染的主要標(biāo)本來(lái)源有血液、尿液、唾液、乳汁、臍帶血等。本文針對(duì)臨床受檢者血液和尿液中981例hCMV-DNA定量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性統(tǒng)計(jì)分析。從表1中可以看出，981例hCMV-DNA定量檢測(cè)結(jié)果中男性hCMV-DNA陽(yáng)性率高于女性。從表2中可以看出，尿液樣本hCMV-DNA陽(yáng)性率為39.22%，而血液分離單個(gè)核細(xì)胞樣本hCMV-DNA陽(yáng)性率為9.22%，2種檢測(cè)方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該報(bào)道中2種標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率低于朱艷等[5]報(bào)道的尿液樣本陽(yáng)性率為70.43%和血液分離單個(gè)核細(xì)胞樣本陽(yáng)性率為49.09%，但2項(xiàng)結(jié)果均顯示尿樣本陽(yáng)性率比血樣本陽(yáng)性率高。唾液腺和腎臟是hCMV感染的最主要排毒部位，尿液中可能存在高濃度的hCMV-DNA載量，可造成尿液樣本hCMV-DNA陽(yáng)性率顯著高于血液分離單個(gè)核細(xì)胞樣本。

為更準(zhǔn)確地分析2種樣本基于Genlier96e型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)陽(yáng)性率的差異，在167例檢測(cè)陽(yáng)性樣本中篩選出感染者在同一時(shí)期內(nèi)2種樣本聯(lián)合檢測(cè)的樣本共91例。因hCMV具有潛伏-活化的生物學(xué)特性且hCMV-DNA載量與活動(dòng)性感染呈正相關(guān)，高載量或動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中出現(xiàn)載量明顯升高提示活動(dòng)性感染可能，故根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)將hCMV-DNA載量不同的91例陽(yáng)性標(biāo)本分為弱陽(yáng)性和陽(yáng)性進(jìn)行2類(lèi)不同樣本檢出情況分析。從表3中可以看出，尿標(biāo)本hCMV-DNA弱陽(yáng)性而血液樣本陰性標(biāo)本占比16.48%，尿標(biāo)本hCMV-DNA陽(yáng)性而血液樣本陰性標(biāo)本占比56.04%，2種情況合計(jì)高達(dá)72.53%；血液樣本hCMV-DNA弱陽(yáng)性而尿標(biāo)本陰性占比2.20%，血液hCMV-DNA陽(yáng)性而尿標(biāo)本陰性占比1.10%，尿樣本2種情況合計(jì)低至3.30%?；?種樣本聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果，尿標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率高達(dá)96.70%，而血液樣本陽(yáng)性率低至27.47%。另外，血液樣本hCMV-DNA陽(yáng)性而尿標(biāo)本陰性的1例標(biāo)本患者在2021年5月3日尿定量hCMV-DNA檢測(cè)中呈陽(yáng)性，血尿2種類(lèi)型標(biāo)本陽(yáng)性結(jié)果具有一致性。從FQ-PCR結(jié)果推知，當(dāng)臨床感染癥狀時(shí)，血液樣本當(dāng)聯(lián)合尿標(biāo)本同時(shí)送檢進(jìn)行hCMV-DNA檢測(cè)，以避免漏診hCMV感染。該結(jié)果可能部分由于年長(zhǎng)兒和成人免疫正常時(shí)，hCMV感染多局限于唾液腺和腎臟，少數(shù)累及淋巴細(xì)胞。另外，由于腎臟是無(wú)癥狀hCMV感染者常見(jiàn)排毒部位且排毒時(shí)長(zhǎng)可達(dá)數(shù)年之久，尿液中檢出hCMV-DNA需謹(jǐn)慎解釋[4]。hCMV感染高發(fā)人群主要包括母親孕期有原發(fā)感染或再發(fā)感染的新生兒，1歲以下嬰兒，接受骨髓、干細(xì)胞或?qū)嶓w器官移植者，接受大劑量或長(zhǎng)期免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療者等[4,6-7]。從表4中可以看出，167例陽(yáng)性樣本來(lái)源患者年齡信息，12月齡以?xún)?nèi)例數(shù)最多共117例(包括1例4 d新生兒)，占總陽(yáng)性數(shù)的70.06%，其中2～4個(gè)月齡比例數(shù)最多，占此月齡段患兒的56.41%；2～9歲23例，占總陽(yáng)性數(shù)的13.77%，其中2～4歲幼兒例數(shù)最多，占此年齡段患兒的86.96%；20歲以上成人27例，散在分布。此結(jié)果與1歲以下嬰兒屬于高峰人群相符[4]，且顯示2～4個(gè)月齡具有占比最高的分布特點(diǎn)。

本研究分析主要針對(duì)Genlier96e型FQ-PCR儀定量檢測(cè)尿標(biāo)本和血液分離單個(gè)核細(xì)胞樣本的hCMV-DNA的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由于hCMV感染存在多種檢測(cè)方法[8-10]，hCMV-DNA陽(yáng)性結(jié)果與臨床hCMV感染診斷結(jié)果之間存在偏差。從表3中可以看出，hCMV-DNA陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)時(shí)直接用尿標(biāo)本和血液分離單個(gè)核細(xì)胞樣本hCMV-DNA陽(yáng)性例數(shù)作為hCMV感染例數(shù)，此種方法統(tǒng)計(jì)的檢測(cè)陽(yáng)性率雖與臨床hCMV感染實(shí)際檢測(cè)陽(yáng)性率存在偏差，但可真實(shí)反映基于FQ-PCR法檢測(cè)2種不同臨床樣本在診斷hCMV感染中的分析性能。從表4中可以看出，對(duì)hCMV-DNA陽(yáng)性標(biāo)本來(lái)源的月齡/年齡分布進(jìn)行分析，但由于感染臨床表現(xiàn)癥狀多樣性，未對(duì)每個(gè)年齡段對(duì)應(yīng)的臨床診斷進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。hCMV-DNA陽(yáng)性患者的臨床癥狀中有58例表現(xiàn)為支氣管肺炎，13例表現(xiàn)為肺炎，18例表現(xiàn)為肝膽系統(tǒng)疾病，6例表現(xiàn)為血小板減少，4例表現(xiàn)為腎臟系統(tǒng)疾病等，這與巨細(xì)胞感染相關(guān)的肺炎[11-12]、肝肝膽疾病[13]、血小板減少[14]和腎臟疾病[15]等臨床癥狀相符。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，送檢樣本中有血液標(biāo)本726例和尿液標(biāo)本255例，然而尿液標(biāo)本較血液分離單個(gè)核細(xì)胞樣本hCMV-DNA陽(yáng)性率高，且尿液具有易采集、接受率高和檢測(cè)操作過(guò)程簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，巨細(xì)胞感染診斷應(yīng)提高尿液標(biāo)本送檢率。

綜上所述，血液和尿液hCMV-DNA聯(lián)合檢測(cè)可提高h(yuǎn)CMV感染診斷的準(zhǔn)確性，對(duì)于血hCMV-DNA檢測(cè)結(jié)果為陰性，但結(jié)合臨床癥狀與體征hCMV感染可能性較大的患者，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尿hCMV-DNA檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)早期診斷和早治療。