秦建增 杜世奇 張玉華

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染為臨床上比較常見的傳染性疾病，其引起的肝硬化能夠造成肝細(xì)胞的再生與肝臟的持續(xù)性炎癥，大約75%的小肝癌患者發(fā)病前伴隨有肝硬化。不過從乙肝繼發(fā)到小肝癌的周期比較長，也涉及到細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的異常表達(dá)[1-2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度介于200到10萬個(gè)核苷酸之間的沒有編碼功能的RNA，在早期被認(rèn)為是DNA轉(zhuǎn)錄異常的產(chǎn)物[3]。隨著研究技術(shù)的深入，已有研究顯示lncRNA在癌組織中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，其可通過吸附或調(diào)控小RNA(miRNA)來參與基因和蛋白的調(diào)控，從而可作為惡性腫瘤的診斷標(biāo)志物[4]。同源異形盒基因A11反義RNA(HOMEOBOX A11 antisense RNA，HOXA11-AS)是1種與惡性腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)的lncRNA，能反映腫瘤的分級(jí)與預(yù)測(cè)預(yù)后[5-6]，本文具體探討了lncRNA HOXA11-AS在乙肝繼發(fā)小肝癌中的表達(dá)意義，希望為臨床上進(jìn)一步探索影響小肝癌發(fā)生的分子機(jī)制提供參考?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2017年2月到2020年5月選擇在本院接受診治的乙肝肝硬化患者268例，其中200例為單純乙肝肝硬化患者(肝硬化組)，68例為乙肝繼發(fā)小肝癌患者(小肝癌組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：血清乙肝表面抗原(HBsAg)陽性；本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究；患者簽署了知情同意書；年齡20～75歲；都符合單純乙肝肝硬化或乙肝繼發(fā)小肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前3個(gè)月有護(hù)肝藥物使用史的患者；轉(zhuǎn)移性肝癌患者；合并有膽汁淤積性肝病、酒精性肝病、脂肪性肝病、自身免疫性肝病等患者；精神系統(tǒng)疾病患者；既往有任何放療、化療等患者。

1.2 lncRNA HOXA11-AS表達(dá)檢測(cè)

采用EDTA 抗凝血型管采集所有患者的血液標(biāo)本2～3 ml，24 h內(nèi)采用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行混合，3 000 rpm/min離心20 min，取血細(xì)胞。使用Tizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄條件設(shè)定為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 8 min。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA濃度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其進(jìn)行稀釋溶解后用于PCR測(cè)定。PCR引物根據(jù)lncRNA HOXA11-AS在NCBI中的序列通過NCBI primer進(jìn)行分析，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，以U2作為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 調(diào)查資料

調(diào)查2組患者的性別、年齡、體重指數(shù)、AFP、ALT、AST值等指標(biāo)，記錄小肝癌組患者的腫瘤最大直徑、臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤包膜、組織學(xué)分化等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

本研究采用SPSS19.00統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量數(shù)據(jù)(對(duì)比為t檢驗(yàn))，采用%、率等表示計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)(對(duì)比為卡方χ2分析)，采用單因素和Cox多因素分析數(shù)據(jù)資料，P<0.05時(shí)差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料對(duì)比

2組的性別、年齡、體重指數(shù)、AFP、ALT、AST值對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料對(duì)比

2.2 lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

小肝癌組的lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平(21.48±1.38)顯著高于肝硬化組(2.09±0.14)(t=78.922，P<0.001)。

2.3 不同病理特征與lncRNA HOXA11-AS表達(dá)水平的相關(guān)性

在小肝癌組中，lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤最大直徑、臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤包膜、組織學(xué)分化存在相關(guān)性(P<0.05)。見表2。

表2 乙肝繼發(fā)小肝癌患者的不同病理特征與lncRNA HOXA11-AS表達(dá)水平的相關(guān)性

2.4 影響因素分析

在小肝癌組中，以lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平作為因變量，以腫瘤最大直徑、臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤包膜、組織學(xué)分化作為自變量，單因素和Cox多因素分析顯示臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化、腫瘤包膜為影響lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平的主要因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響乙肝繼發(fā)小肝癌患者lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平的單因素與多因素分析(n=68)

3 討論

小肝癌具有發(fā)病率高、預(yù)后差、容易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，但小肝癌多由乙肝肝硬化發(fā)展而來，也是多步驟、多階段的過程，其開始于肝組織受到乙肝病毒感染導(dǎo)致的肝硬化過程，為此早期篩查與診斷具有重要價(jià)值[7]。近年來，為了提高小肝癌的早期診斷率，已有AFP、ALT、AST等血清標(biāo)志物應(yīng)用于肝癌的診斷，但是診斷敏感度或特異度均不夠理想。本研究也顯示2組的性別、年齡、體重指數(shù)、AFP、ALT、AST值對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，為此需要繼續(xù)在臨床上尋找與小肝癌診斷或預(yù)后評(píng)估有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。

lncRNA在人體機(jī)制中的調(diào)控作用已經(jīng)逐漸得到學(xué)術(shù)界認(rèn)可和重視，lncRNA分子在許多腫瘤疾病中都參與發(fā)揮著調(diào)控作用。lncRNA在體液中的存在形式比較穩(wěn)定，可以持續(xù)地被檢測(cè)到，對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的變化反應(yīng)也較為靈敏。它可以通過與各蛋白分子及蛋白復(fù)合物相結(jié)合，對(duì)相鄰蛋白的編碼基因表達(dá)造成影響，發(fā)揮染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾、轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)作用。已有不少研究證明了lncRNA在乳腺癌、肺細(xì)胞癌、胃癌患者體內(nèi)有異常表達(dá)情況，可以作為其病理診斷的臨床獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[8-9]。同源盒(homeobox，HOX)家族基因與胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生存在相關(guān)性，其也為一種高度保守的同源異形結(jié)構(gòu)域。HOX包括A、B、C、D 4個(gè)簇，其中HOXA基因簇5’區(qū)域的方向涉及到正義鏈中編碼蛋白質(zhì)的基因，lncRNA HOXA11-AS作為其中一種新的長鏈非編碼RNA，位于染色體7p15.2上，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、漿液性卵巢癌、上皮性卵巢癌、宮頸癌、骨肉瘤、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等發(fā)揮著促癌或抑癌等作用[10-11]。本研究顯示小肝癌組的lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平高于肝硬化組(P<0.05)，表明乙肝繼發(fā)小肝癌患者多伴隨有l(wèi)ncRNA HOXA11-AS的高表達(dá)，lncRNA HOXA11-AS也在小肝癌中發(fā)揮著促癌作用。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種肝癌相關(guān)的IncRNA已被鑒定，IncRNA可通過各種不同機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等過程。有研究通過對(duì)PC3細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA的過表達(dá)質(zhì)粒后進(jìn)行增殖活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LNCaP細(xì)胞在過表達(dá)lncRNA之后，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，當(dāng)對(duì)lncRNA表達(dá)進(jìn)行敲減之后，細(xì)胞增殖能力也顯著降低[12]。有學(xué)者對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行Transwell小室模擬實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的遷移侵襲能力在lncRNA分子敲減之后顯著降低，證明lncRNA的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力相關(guān)[13]。有研究通過建立裸鼠模型進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lncRNA的裸鼠體內(nèi)肝臟發(fā)生多發(fā)轉(zhuǎn)移，證明lncRNA在肝癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展中的推動(dòng)作用[14-15]。本研究顯示小肝癌患者的lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤最大直徑、臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤包膜、組織學(xué)分化存在相關(guān)性(P<0.05);單因素和Cox多因素分析顯示臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化、腫瘤包膜為影響lncRNA HOXA11-AS相對(duì)表達(dá)水平的主要因素(P<0.05)，說明小肝癌患者的病理特征與lncRNA HOXA11-AS表達(dá)水平存在相關(guān)性。

當(dāng)前也有研究表明lncRNA HOXA11-AS為胃癌患者中表達(dá)顯著上調(diào)，敲低lncRNA HOXA11-AS可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷徙、侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期[16]。lncRNA HOXA11-AS可通過富集miR-140—5p途徑調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的發(fā)生，lncRNA HOXA11-AS表達(dá)水平較高的患者預(yù)后較差[17]。不過lncRNA的生物學(xué)功能在腫瘤的病程變化的同時(shí)也會(huì)發(fā)生變化，因此需要對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，避免在治療中發(fā)生不可預(yù)料的副作用，逐漸挖掘其臨床治療價(jià)值。

總之，lncRNA HOXA11-AS在乙肝繼發(fā)小肝癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)情況，臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化、腫瘤包膜與lncRNA HOXA11-AS表達(dá)存在相關(guān)性，也是影響lncRNA HOXA11-AS的主要因素。