董延琥 王藝靜

細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡通常是由化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)的，并且在人類癌癥的臨床治療中起著至關(guān)重要的作用，其受許多凋亡相關(guān)基因和信號(hào)通路的調(diào)控[1]。miR-150-5p已經(jīng)被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)異常[2]?；诖?，本研究旨在探討miR-150-5p與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡之間的聯(lián)系，以及其調(diào)控非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Lipofectamine 3000購自廣州雙螺旋生物科技有限公司(貨號(hào)：L3000015)。人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購自深圳市科普生物有限公司(貨號(hào)：IFO50153)。pmir-glo utr1質(zhì)粒購自廣州基旦生物科技有限公司(貨號(hào)：JD190929001M)。miR-150-5p inhibitor、miR-150-5p mimics均由上海生工合成。siPDIA6和siTADA1由吉?jiǎng)P基因合成。PDIA6過表達(dá)質(zhì)粒通過HELA細(xì)胞的cDNA克隆至pCDNA3.1表達(dá)載體上。RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京華博德億生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：SH30809.02B)。胎牛血清購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：HQ30071)。PDIA6 antibody購自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司(貨號(hào)：GTX11432)。GAPDH antibody購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司(貨號(hào)：R1210-1-200ul)。RNA小量提取試劑盒購自北京欣華綠源科技有限公司(貨號(hào)：R6834-00)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自昆明皇寶商貿(mào)有限公司(貨號(hào)：218161)。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自武漢潔洋盛科技有限公司(貨號(hào)：M337-5ML)。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司(貨號(hào)：CDLG-4997)。黃芩苷購自上海麥克林生化科技有限公司(貨號(hào)：B802696-1g)。熒光定量PCR試劑盒購自上海兢蔚生物科技有限公司(貨號(hào)：BL705A)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，并在37 °C，5%CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 μU/ml青霉素。將轉(zhuǎn)染試劑與miR-150-5p inhibitor、miR-150-5p mimics、PDIA6質(zhì)粒、siPDIA6和siTADA1混合并在室溫下孵育15 min后，緩緩滴入非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中。

1.2.2 RNA抽取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)說明書，使用RNA小量提取試劑盒提取的RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.2.3 Annexin-V染色 經(jīng)過不同處理后，收集在6孔板上生長(zhǎng)的漂浮非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和胰蛋白酶分離的細(xì)胞，并用冷的PBS洗滌。 然后將細(xì)胞沉淀物用結(jié)合緩沖液重懸，并根據(jù)試劑盒方案用Annexin-V染色。熒光顯微鏡觀察。將實(shí)驗(yàn)組中凋亡細(xì)胞的百分比與對(duì)照轉(zhuǎn)染組進(jìn)行比較。所有樣品一式三份測(cè)量。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞與PDIA6(800 ng)、對(duì)照載體(800 ng)的TK Renilla報(bào)告基因(8 ng)根據(jù)試劑盒說明，使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，裂解了總細(xì)胞蛋白，并使用雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)了熒光素酶活性(螢火蟲和海腎)。

1.2.5 免疫印跡 使用RIPA緩沖液從非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中提取總細(xì)胞蛋白，然后以12 000 rpm離心20 min。 4 °C收集上清液。使用二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量這些蛋白質(zhì)樣品的濃度。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中分離蛋白質(zhì)樣品(每個(gè)泳道30 μg)，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與所示第一抗體在4 °C下孵育過夜。第2天，將膜與偶聯(lián)了辣根過氧化物酶(HRP)的相應(yīng)抗小鼠或抗兔IgG二抗在室溫下孵育1 h。蛋白質(zhì)條帶使用Western Bright ECL試劑盒，然后使用ChemiDocTMXRS+系統(tǒng)進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-150-5p對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的抑制作用

使用miR-150-5p mimics過表達(dá)miR-150-5p后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平顯著下降(P<0.05)；使用miR-150-5p inhibitor敲低miR-150-5p后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平顯著上升(P<0.05)，見圖1。

注：*P<0.05。圖1 miR-150-5p對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549凋亡的作用

2.2 miR-150-5p對(duì)PDIA6和TADA1表達(dá)的抑制作用

使用miR-150-5p mimics過表達(dá)miR-150-5p后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中PDIA6和TADA1的表達(dá)顯著下降(P<0.05)；使用miR-150-5p inhibitor敲低miR-150-5p后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中PDIA6和TADA1的表達(dá)顯著上升(P<0.05)，見圖2。

2.3 miR-150-5p靶向PDIA6調(diào)控A549細(xì)胞凋亡水平的機(jī)制

使用siPDIA6和siTADA1分別敲低PDIA6和TADA1后，發(fā)現(xiàn)敲低PDIA6的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平明顯下降(P<0.05)，而敲低TADA1的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平無顯著變化(P>0.05)，見圖3A；通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR-150-5p靶向PDIA6(P<0.05)，見圖3B；通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)PDIA6后(見圖3C)，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平明顯上升(P<0.05)，見圖3D。

圖3 miR-150-5p靶向PDIA6調(diào)控A549細(xì)胞凋亡水平

2.4 miR-150-5p/PDIA6回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

同時(shí)敲低miR-150-5p和PDIA6后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平無顯著變化(P>0.05)，見圖4A；同時(shí)過表達(dá)miR-150-5p和PDIA6后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平無顯著變化(P>0.05)，見圖4B。

圖4 miR-150-5p/PDIA6回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

3 討論

從組織學(xué)上講，肺癌可以分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌[3]，大約85%的肺癌病例被診斷為NSCLC[4]。盡管在過去的幾十年中，早期檢測(cè)和治療策略取得了許多進(jìn)步，但5年生存率仍低于20%[2]。因此，關(guān)于非小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)理和分子機(jī)制的研究對(duì)于提升非小細(xì)胞肺癌的5年生存率至關(guān)重要。

microRNA是小的非編碼RNA，在許多生物學(xué)過程中起重要作用。miRNA在非小細(xì)胞肺癌中失調(diào)，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性[5]。已有研究報(bào)道[2]，miR-150-5p已經(jīng)被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌中失調(diào)。在本研究中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-150-5p后，非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平顯著下降(P<0.05)；敲低miR-150-5p后，非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平顯著上升(P<0.05)。除了在非小細(xì)胞肺癌，在各種其他癌癥類型中檢測(cè)到miR-150-5p的表達(dá)失調(diào)，包括肝癌、前列腺癌和白血病。Liu等[6]報(bào)道了miR-150-5p促進(jìn)前列腺癌中的腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。然而，Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)miR-150-5p抑制肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移。這表明miR-150-5p在不同癌癥類型中可能起相反的作用。

microRNA通過直接結(jié)合靶基因mRNA的3'UTR負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，從而導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[8]。在本研究中，過表達(dá)miR-150-5p后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中PDIA6和TADA1的表達(dá)顯著下降(P<0.05)；敲低miR-150-5p后，非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中PDIA6和TADA1的表達(dá)顯著上升(P<0.05)。此外，通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)miR-150-5p靶向PDIA6(P<0.05)。因此，miR-150-5p在A549細(xì)胞中能夠直接靶向PDIA6發(fā)揮其生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低PDIA6的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平明顯下降(P<0.05)，而敲低TADA1的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平無顯著變化(P>0.05)。miRNA充當(dāng)識(shí)別互補(bǔ)mRNA的模板，然后根據(jù)miRNA與目標(biāo)mRNA的互補(bǔ)性，通過直接mRNA降解或翻譯抑制來負(fù)調(diào)控mRNA表達(dá)[8]。因此miR-150-5p能夠引起非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中PDIA6 mRNA的降解。盡管TADA1未能引起非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡水平的改變，但是miR-150-5p是否直接靶向TADA1，以及是否發(fā)揮其他生物學(xué)功能值得進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的代表形式，可通過多種途徑，例如內(nèi)在和外在途徑或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，由化療藥物誘導(dǎo)[9-10]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PDIA6后，非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平明顯上升(P<0.05)。同時(shí)敲低miR-150-5p和PDIA6后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平無顯著變化(P>0.05)；同時(shí)過表達(dá)miR-150-5p和PDIA6后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平無顯著變化(P>0.05)。因此，miR-150-5p是PDIA6調(diào)控非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的上游。半胱氨酸依賴性和天冬氨酸定向蛋白酶家族-胱天蛋白酶在凋亡信號(hào)通路中起著至關(guān)重要的作用[11-13]。例如，caspases-8和caspases-9分別負(fù)責(zé)激活外在和內(nèi)在的凋亡途徑。因此，miR-150-5p/PDIA6調(diào)控的細(xì)胞凋亡通路可能是caspases-9途徑。

綜上所述，miR-150-5p通過靶向PDIA6信使RNA的3端非編碼區(qū)抑制了PDIA6蛋白的翻譯，隨后抑制了非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡水平。